1.2. Các phương pháp xác định PAH
1.2.1. Các phương pháp chiết tách hợp chất PAH
Năm 1975, Grimmer và Bohnke chiết tách PAH từ cá và thịt xông khói với methanol sau khi thủy phân với dung dịch kali hydroxyt – methanol [44] . Thủy phân kiềm thường mất 2-4 giờ, tùy thuộc vào đặc điểm của mẫu. Các mô nạc mất ít thời gian hơn so với các mô mỡ. Thủy phân kali hydroxyt – methanol cũng được chọn trong các nghiên cứu thử nghiệm của Fretheim (1976) và Simko, Dubravicky, Smirnov(1989) [43],[44]. Mặt khác, Vassilaros và cộng sự [44] cho rằng việc sử dụng methanol là không cần thiết vì góp phần tạo ra các metyl este hình thành từ các axit béo và methanol, do đó khó khăn để loại bỏ ra khỏi phần chứa PAH.
Takatsuki và cộng sự [44] thấy rằng trong quá trình thủy phân kiềm benzo(a)pyren có thể được chiết một phần do sự tồn tại của điều kiện kiềm, oxy ánh sáng, và peoxit từ etyl ete. Họ đề xuất bổ sung Na2S làm chất chống oxy hóa, chưng cất etyl ete ngay trước khi sử dụng và tránh không khí tiếp xúc với các chất hấp phụ. Để bảo vệ PAH , Karl và Leinemann (1993) [44] đã sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu, xúc rửa kỹ với aceton trước khi sử dụng. Ngoài ra, một số tác giả cũng đề xuất phương pháp chiết trực tiếp với các dung môi hữu cơ. Potthast và Eigner (1975) [43] đề xuất một quy trình dựa trên sự pha trộn của mẫu với chloroform và khan Na2SO4 để loại bỏ nước từ chiết. Sau khi thêm Celite, phần mỡ trở nên phân bố đều trên bề mặt của vật liệu hấp phụ một số tác giả đã đạt được độ thu hồi 95-100% của benzo(a)pyren . Chiết từ nền mẫu thịt hun khói cũng được thực hiện bởi Afolabi và cộng sự (1983), Cejpek và cộng sự (1995) [44] đã thử nghiệm hiệu quả của một số dung môi hữu cơ để có được phần chất béo của mẫu thịt. Các dung môi có hiệu quả tốt nhất là hỗn hợp của chloroform-methanol (2: 1). Joe và cộng sự [44] phân loại mẫu thực phẩm hun khói với KOH, và chiết PAH với Freon 113 (1,1,2-trichloro- 1,2,2-trifluoroethane) . Các mẫu được chiết bằng máy chiết Dionex cũng như bộ
21
máy Soxhlet. Kỹ thuật chiết ASE (Accelerated Solvent Extraction) là các kĩ thuật chiết lỏng – lỏng dựa trên sự phân bố lại giữ chất tan trong nền mẫu và dung môi chiết tách thích hợp, ở đây để xúc tiến quá trình chiết điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp. Kĩ thuật ASE đã được tìm thấy có thể so sánh, và thậm chí còn tốt hơn, phương pháp Soxhlet, khi giảm đáng kể trong thời gian khai thác (20 phút) và dung môi tiêu thụ đã đạt được (20- 30 ml).
Ưu nhược điểm của phương pháp chiết lỏng lỏng
Ưu điểm: hệ số tách cao RTB > 90%. Đây là phương pháp chiết tách truyền thống có thể ứng dụng cho nhiều dối tượng mẫu
Nhược điểm: Chiết pha lỏng dùng một lượng dung môi đủ lớn để chiết một lượng mẫu có thể phân tich được bằng sắc ký. Hệ số làm giàu thấp hơn chiết pha rắn. Có hiện tượng tạo nhũ tương, ảnh hưởng đến sự phân bố của chất phân tích trong các dung môi chiết
1.2.1.2. Phương pháp chiết pha rắn
Năm 1996, Laffon Lage và cộng sự [52] đã sử dụng kỹ thuật SPE với cột C18 đạt được độ thu hồi 91% benzo(a)pyren. Năm 2000, Maria Dolores Guillén và cộng sự [58] sử dụng hai cột SPE, Florisil và silicagen, cùng các chương trình rửa giải khác nhau để chiết PAH. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng lưu giữ của ống silicagen là thấp hơn ống Florisil, n – hexan có thể rửa giải các PAH, dichlometan có ái lực cao với một số PAH. Năm 2003, Wolfgang Jira [48] dùng cột SPE là cột silicagen với thành phần CN / SiOH (500/1000 mg) và rửa giải các PAH khỏi cột bằng hỗn hợp acetonitril-toluen (75:25). Trong các nghiên cứu khác, quá trình chiết PAH được thực hiện trên cột SPE với nhiều pha tĩnh khác nhau như C18 / C8, aminopropyl, silicagen và polystyren / divinylbenzen (PS-DVB), hỗn hợp C18 / Florisil [21] và PS-DVB [75] . Một số nghiên cứu cho thấy PS-DVB có tính chọn lọc PAH rất cao, phù hợp với hầu hết đối tượng mẫu thực phẩm [72]. Gần đây, axit
22
humic gắn với silicagen đã được đề xuất như một chất hấp phụ mới để tách các PAH bằng SPE [56].
1.2.1.3. Phương pháp chiết QuEChERS
Phương pháp chiết QuEChERS (viết tắt của: Quick- nhanh, Easy - dễ dàng, Cheap - rẻ, Effective - hiệu quả, Rugged- bền vững và Safe - an toàn) [9] [65] [68]
dựa trên nguyên tắc chiết một lần với acetonitril đã được đệm hoá và tách ra khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng - lỏng nhờ muối magie sunfat (MgSO4). Quá trình làm sạch bằng chiết pha rắn (d-SPE) được dùng để loại các axít hữu cơ, nước còn dư và các tạp chất khác nhờ phối hợp chất hấp phụ amin bậc một, bậc hai và MgSO4. Dịch chiết sau khi làm sạch có thể được phân tích bằng kĩ thuật sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GC) kết hợp với nhiều loại detector khác nhau.
Bảng 1.3. So sánh QuEChERS với phương pháp truyền thống Phương pháp truyền thống Phương pháp QuEChERS
Xay trộn Lắc
Thể tích dung môi lớn Thể tích dung môi nhỏ
Nhiều bước chiết Chỉ một giai đoạn
Lấy toàn bộ thể tích Lấy một phần
Nhiều dụng cụ thuỷ tinh Dùng ống ly tâm Cô cạn và làm giàu mẫu Tiêm thể tích lớn
Làm sạch bằng chiết pha rắn SPE Làm sạch bằng d – SPE
Ngày nay phương pháp QuEChERS đã được triển khai trên nhiều đối tượng khác nhau như đa dư lượng thuốc thú y, acryamid, PAH...
Để đối phó với sự cố tràn dầu thô BP Deepwater Horizon FDA đã phát triển một phương pháp sàng lọc thông lượng cao sử dụng chiết QuEChERS và sắc ký
23
lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD ) (Gratz và cộng sự 2011) [31] . Sử dụng phương pháp này, phải mất ít nhất 24 giờ để một nhà phân tích đồng nhất hoàn toàn 20 mẫu . Tuy nhiên, các phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là phương pháp hiện đang được sử dụng để xác nhận sự sàng lọc (Sloan và cộng sự 2010) lại tốn nhiều thời gian và lao động để loại bỏ đồng chiết xuất gây ra vấn đề trong phân tích sắc ký GC mao mạch . Các quy trình phải mất 5 ngày cho để các nhà phân tích phân tích 15 mẫu. Vì vậy cần một phương pháp nhanh chóng với giới hạn phát hiện ở mức thấp mà cung cấp nhận dạng chất phân tích bằng quang phổ khối lượng. Năm 2011, Smoker và cộng sự [68] đã sử dụng phương pháp QuEChERS để phân tích dư lượng PAH trong tôm bằng LC-MS/MS. Nhưng, trong một nghiên cứu thí điểm của tác giả, GC-MS/MS phát hiện benzo(a)pyren ở mức dưới 1 àg/kg. Điều này cho thấy GC-MS/MS sẽ cung cấp cho giới hạn phỏt hiện thấp hơn khoảng 10 lần so với LC-MS/MS nguồn APPI . Năm 2005, Lehotay và cộng sự [53] đã chứng minh rằng sử dụng chiết pha rắn phân tán (d-SPE) với các amin bậc một và bậc hai (PSA) và octadecylsilan (C18) có thể ứng dụng hiệu quả chiết xuất các loại thực phẩm có hàm lượng béo vừa phải. Nhưng, một ứng dụng của QuEChERS để chiết PAH từ cỏ hồi cú nhiều chất bộo ở mức 500 àg/kg độ thu hồi đạt được ít hơn 70% [39].