CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp xác nhận giá trị hiệu lực phương pháp
Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn.
Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định thêm bằng số điểm xác nhận (IP) và tỷ lệ các ion được tính theo quy định EC/657/2002 của Châu Âu [54].
- Số điểm xác nhận là tổng điểm ion mẹ và ion con, trong đó đối với kỹ thuật GC-MS/MS mỗi ion mẹ được tính 1 điểm và mỗi ion con được tính 1,5 điểm. Số điểm xác nhận tối thiểu phải đạt đối với PAH là 4 điểm.
- Tỷ lệ ion là tỷ lệ phần trăm của ion con có tín hiệu thấp hơn, chia cho ion con có tín hiệu cao hơn của cùng một PAH. Tỷ lệ ion của mỗi PAH phát hiện trên mẫu so với tỷ lệ tương ứng trên chuẩn cần phải đáp ứng yêu cầu được cho trong bảng sau [54]:
Bảng 2.2. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion Tỷ lệ ion (%) Sai lệch cho phép (%)
> 50 ± 20
> 20 đến 50 ± 25
> 10 đến 20 ± 30
≤ 10 ± 50
2.3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Trong nghiên cứu này LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị.
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu nền của thiết bị (S/N = 3).
32
LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
Khoảng tuyến tính: Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng độ của chất đó.
Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích píc thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính.
Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu:
- Lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp với đối tượng thử, trong nghiên cứu này các đường chuẩn trên nền mẫu thịt bò tươi không phát hiện thấy PAH.
- Phân tích mẫu trắng để thu được dịch chiết các mẫu trắng.
- Pha dãy chuẩn trên nền dịch chiết mẫu trắng.
- Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích của từng PAH theo nồng độ PAH tương ứng.
Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên hai tiêu chí:
- Hệ số tương quan tuyến tính, R2≥ 0,99
- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆i ≤ 15%, (∆i ≤ 20% tại LOQ). Độ chệch được tính theo công thức sau:
100 )
( ) ( )
(
lt Ci
lt Ci tt Ci i
Trong đó:
Ci(tt) là nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm chuẩn thứ “i”, tính theo ng/mL.
Ci(lt) là nồng độ lý thuyết (nồng độ pha dung dịch chuẩn) của điểm chuẩn thứ
“i”, tính theo ng/mL.
33
2.3.4.4. Độ lặp lại (độ chụm), độ thu hồi (độ đúng)
Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu. Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD%. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích. Các công thức tính toán như sau:
+ Giá trị trung bình :
n
1 i
xi
n x 1
Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn :
1 n
) x x ( SD
2 n
1 i
i
+ Độ lệch chuẩn tương đối: 100 X RSDSD
Bảng 2.3. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD(%)
1 100 1 100% 1,3
2 10 10-1 10% 1,8
3 1 10-2 1% 2,7
4 0,1 10-3 0,1% 3,7
5 0,01 10-4 100ppm 5,3
6 0,001 10-5 10ppm 7,3
7 0.0001 10-6 1ppm 11
8 0,00001 10-7 100ppb 15
9 0,000001 10-8 10ppb 21
10 0,0000001 10-9 1ppb 30
34
- Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kỹ thuật thêm chuẩn.
Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%) được tính như sau:
C 100 C
% C R
c m c
m
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Bảng 2.4. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC
TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
1 100 1 100% 98 – 102
2 10 10-1 10% 98 – 102
3 1 10-2 1% 97 – 103
4 0,1 10-3 0,1% 95 – 105
5 0,01 10-4 100ppm 90 – 107
6 0,001 10-5 10ppm 80 - 110
7 0.0001 10-6 1ppm 80 - 110
8 0,00001 10-7 100ppb 80 - 110
9 0,000001 10-8 10ppb 60 - 115
10 0,0000001 10-9 1ppb 40 - 120