CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng giống
2.3. Môi trường nuôi cấy
2.3.1. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất đơn giản Danh mục hóa chất, xuất xứ
Glycerol: Trung quốc Pepton: Merck
Glucose: Merck Xylose: Merck KH2PO4: Merck
Na2HPO4.12H2O: Merck FeSO4.7H2O: Merck ZnSO4.7H2O: Merck CuSO4.5H2O: Merck
Kal (SO4)2.12H2O: Merck H3BO3: Merck
Na2MoO4.2H2O : Merck NiCl2.6H2O : Merck Na2SeO3.5H2O: Merck Cao nấm men: Merck Reazurin: Sigma
CysteinHCl.H2O : Sigma
Và một số hóa chất thông dụng khác.
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [21].
- Các bước pha môi trường và thành phần của môi trường bao gồm:
• Dung dịch gốc 1: KH2PO4: 1.5 g/l Na2HPO4.12H2O: 4.2 g/l
29
• Dung dịch gốc 2: MgCl2.6H2O: 0.2 g/l
• Tiền môi trường (1 lít): 100 ml dung dịch gốc 1 100 ml dung dịch gốc 2
200μl reazurin (1.0mg/l) 15 ml TES
• Môi trường: 1 lít tiền môi trường Cao nấm men: 2g/l
NaCl: 20g/l
Nguồn carbon (glucose, xylose, glycerol): 5g/l CysteinHCl.H2O: 1.1g/l
• Trong đó, TES (trace elements solution) bao gồm các thành phần sau:
Nitrilotriacetic acid : 1.5 g/l MgSO4.7H2O : 3.0 g/l MnSO4.2H2O : 0.5 g/l NaCl : 1.0 g/l
FeSO4.7H2O : 0.1 g/l CoSO4.7H2O : 0.18 g/l CaCl2.2H2O : 0.1 g/l
ZnSO4.7H2O : 0.18 g/l CuSO4.5H2O : 0.01 g/l KAl (SO4)2.12H2O : 0.02 g/l H3BO3: 0.01 g/l
Na2MoO4.2H2O : 0.01 g/l NiCl2.6H2O : 0.025 g/l Na2SeO3.5H2O : 0.3 mg/l
- Cách pha TES (Trace element solution): Khi pha TES, ta phải hòa tan Nitrilotriacetic acid trước vào 500ml nước cất và điều chỉnh pH về 6.5 bằng KOH vì Nitrilotriacetic acid là một acid rất khó để hòa tan. Sau đó thêm các chất khoáng còn lại và nước cất cho đến 1000ml và điều chỉnh pH cuối cùng của TES là 7.0 bằng KOH.
- Khi môi trường đã được pha xong thì pH của môi trường được điều chỉnh về 7.5 bằng NaOH.
- Mỗi 15ml môi trường sẽ được cho vào bình serum 30ml sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhôm bên ngoài.
- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết trong khoảng 5 phút để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo môi trường kị khí.
30
- Khi môi trường nuôi cấy trong bình serum trở nên trong suốt và lắc lên không thấy có hiện tượng chuyển sang màu hồng thì môi trường đó đã sẵn sàng để cấy giống.
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 75oC, 100 rpm.
2.3.2. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là bã đậu Tiền xử lí bã đậu:
• Bã đậu khi mang về sẽ được xử lí nhiệt 90o trong 15 phút để tiêu diệt các vi khuẩn tiêu thụ Hydro
• Sau đó bã đậu được pha loãng với nước cất ở tỉ lệ 1:4 (w/w)
• Trộn đều bằng máy xay trong khoảng 1 phút
• Tiếp tục được xử lí với H2SO4 0.5% (v/v) trong vòng 5 phút để làm tăng hàm lượng Carbohydrate hòa tan.
• Các chỉ tiêu COD, tổng Nitơ, tổng Photpho đươ ̣c phân tích tại Viê ̣n Hoá cơ bản - Trường Đa ̣i ho ̣c Bách khoa Hà Nô ̣i
2.3.3. Môi trường nuôi cấy với nguồn cơ chất là glycerol Tiền xử lí chất thải glycerol thô
Trước khi được sử dụng làm cơ chất cho quá trình nuôi cấy kị khí chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM, chất thải glycerol thô cần phải được qua bước tiền xử lí vì nó thường chứa methanol và ethanol. Do đó, đầu tiên, cần phải loại bỏ các chất này thông qua quá trình khô quay ở 45oC. Tiếp đến, các chất rắn sẽ được kết tủa bởi sự ly tâm tại 15000 rpm trong 15 phút.
2.3.4. Môi trường nuôi cấy với cơ chất là rơm, rạ 2.3.4.1. Quy trình xử lý rơm, rạ
Bước 1: Xử lý cơ học: Rơm rạ được cắt nhỏ từ 5-10 cm, sau đó nghiền nát và lọc qua lưới sàng kích thước 1mm.
Bước 2: Xử lý hóa học:
- Tiền xử lý với NH3: Rơm được xử lý bằng NH3 10%. Sau đó, phần chất rắn được thu hồi và rửa sạch bằng nước.
- Tiền xử lý với H2SO4: Phần rắn sau khi đã được xử lý bằng NH3 10% sẽ được xử lý tiếp với H2SO4 1%.
31
2.3.4.2. Phương pháp xác định thành phần rơm, rạ (Nguyen và cs, 2008)
Dùng acid sulfuric 72% 24N để hydro hóa và hòa tan các cacbohydrat trong gỗ; lignin không hòa tan trong axit được lọc và cân
- Cách pha hóa chất:
Axit sulfuric 72% 24N, trọng lượng riêng 1.6338 được chuẩn bị như sau: Rót 665ml acid sulfuric đậm đặc vào 300ml nước, làm lạnh pha thành 1000 ml, điều chỉnh nồng độ thành 24N bằng cách chuẩn độ với kiềm. Hỗn hợp ethanol-benzen: 1 thể tích ethanol 95% và 2 thể tích benzene.
- Cách tiến hành:
Lấy 2g bột rơm, cho 25 ml hỗn hợp ethanol - benzen vào, để yên trong 30 phút, gạn bỏ hỗn hợp trên, cho thêm 25ml ethanol dể trong 15 phút, gạn bỏ ethanol, rửa lại bằng nước nóng, lọc để loại nước. Bột rơm được sấy khô trong tủ sấy 60ºC.
Cân lấy 1g bột rơm đã loại resin cho vào bình 250ml, cho từ từ 15ml H2SO4 72%
vào, dùng đũa khuấy thật kĩ giữ mẫu ở 2ºC cho đến khi tan mẫu. Sau khi mẫu tan, bao miệng bình lại và giữ ở nhiệt độ thường trong hai giờ. Thường xuyên khuấy cho đến khi mẫu trong bình tan thành dịch. Cho khoảng 300 - 400ml nước vào bình 1000ml và chuyển mẫu từ bình 250ml vào, rửa và pha loãng tới thể tích 575ml (độ H2SO4 khoảng 3%). Lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu) và đun trong 4 giờ kể từ lúc sôi. Để yên cho lắng tủa, hút bỏ phần dịch nổi, rửa axit lẫn trong lignin với nước nóng, làm khô lignin bằng cách sấy ở 105ºC đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân.
- Cách tính kết quả:
Kết quả tính ra hàm lượng lignin trong 1g mẫu.
Công thức tính: hàm lượng lignin = x 100 (%)
Trong đó: A = trọng lượng của lignin (g) W = trọng lượng khô của mẫu (g)
A W
32
Đo hàm lượng cellulose sau khi phân hủy lignin: (Nguyen và cs, 2008)
- Cân 1-2 g mẫu đã sấy khô, cho vào bình cầu dung tích 500ml. Thêm vào 200 ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn ngược (hồi lưu và đun nhẹ trong 30 phút (không để bọt trào lên). Kĩ thuật này dùng để hòa tan tinh bột, các pectin, lignin có tính chất acid và ít kết hợp với cellulose, không ảnh hưởng đến hàm lượng cellulose ngay cả những phân tử thấp nhất.
- Lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH nóng, cho cặn cellulose tác dụng với 10ml dung dịch HCl 10% trong bình cầu ở nhiệt độ thường. Thêm 10ml dung dịch nước javen từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều, để yên trong 5 phút rồi lọc. Cho cặn tác dụng với dung dịch NaOH 0.5% ở nhiệt độ 40ºC để hòa tan lignin (đã bị clo hóa), để yên vài phút rồi lọc. Lặp lại hai lần nữa để có cellulose thật trắng.
Rửa kĩ bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân.
Kết quả tính ra hàm lượng cellulose (%) trong 1g mẫu.
Công thức tính: Hàm lượng cellulose = x 100 (%)
Trong đó: A = trọng lượng của cellulose (g) W = trọng lượng khô của mẫu (g)
Quy trình để xác định thành phần carbonhydrate: Đầu tiên, rơm được thủy phân bởi acid sulfuric 72% (w/w) ở 30 °C trong 60 phút, sau đó thủy phân tiếp bằng acid sulfuric 4% (w/w) ở 121°C trong 60 phút (được thực hiện trong lò hấp).Sau đó, thành phần đường được phân tích bằng hệ thống HPLC.