Các phương pháp phân tích

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng giống

2.7. Các phương pháp phân tích

 Sự phát triển của tế bào được đánh giá bằng khối lượng tế bào khô (dry cell weight - DCW) và mật độ tế bào (opical density - OD600) đo bằng máy đo OD. Khí H2 trong headspace được lấy bởi gas-tight syringe, thể tích mỗi lần hỳt là 100 àL (Australia) và được xỏc định bằng phương phỏp sắc kớ khớ GC (7890A; Series: us11501033, USA) được trang bị với một máy dò dẫn nhiệt (TCD) và cột không gỉ cao 2m được bao bởi carboxen 1000, 50/80 mesh (Supelco). Nhiệt độ hoạt động của lỗ chích, lò phản ứng và thiết bị dò lần lượt là 120;60 và 120°C. Argon được sử dụng như khí mang với tốc độ chảy là 55 mL/phút

 Acid acetic và acid lactic được xác định bằng hệ thống sắc kí lỏng cao áp được trang bị với một chỉ số phỏt hiợ̀n (Agilent 1100, USA): 50àL của 0.2àm mụi trường bề mặt đó được lọc được tỏch ra trờn một Rezex ROA- acid hữu cơ H+ (8%) cột 300 x 7.80 mm (Bio-Rad, USA) và được rửa bằng 0.5 mL/phút với 0.005 M °C ở nhiệt độ phòng. Nồng độ cơ chất còn lại cũng được xỏc định bằng sắc kớ lỏng cao ỏp (HPLC) :50àL của 0.2àm mụi trường bề mặt được lấy và phân tích trên một cột Rezex RCM-Monosaccharide (Bio-Rad) và được rửa với 0.5 mL/phút nước ở 60°C. Phát hiện được thực hiện với một máy dò chỉ số khúc xạ (Agilent 1100, USA). Mỗi phép đo được lặp đi lặp lại ba lần.

36

 Kết quả thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh ho ̣c.

 Hiệu suất tạo hydro bằng số mol hydro được tạo ra trên cơ chất được tiêu thụ, và được tính theo công thức sau:

o YH2 = nH2 /nS

(VớiYH2 là hiệu suất tạo hydro, nH2 là số mol H2 sinh ra, còn nS là số mol cơ chất tiêu thụ)

 Tốc độ chảy của số mol hydro được tính theo công thức sau :

(Trong đó: QH2 : tốc độ chảy của số mol hydro (mmol/h), FPH2: tốc độ chảy của thể tích khí từ lò phản ứng (mL/phút), R: Hằng số khí kí tưởng (0.08206 L.atm.mol-1.K-1), T ở 298 OK.)

 Lượng hydro sinh ra (mol) tại thời điểm t được tính theo công thức sau:

(Trong đó: NH2 : Lượng hydro sinh ra tại thời điểm t, QH2: Tốc độ chảy của số mol hydro (mmol/h)

37

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu sự tạo thành hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 từ các nguồn đường đơn

3.1.1. Hoạt hóa, nuôi cấy chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359

Sau 48 giờ nuôi cấy, cho thấy trong bình serum xuất hiện các đặc điểm sau:

- Khi nhẹ nhàng nhấc bình ra khỏi bể nuôi cấy lắc ổn nhiệt, cho thấy đáy bình có những bọt khí nhỏ  chứng tỏ có khí sinh ra.

- Phần nắp cao su ban đầu khi mới thực hiện nuôi cấy thì phẳng, nhưng sau 48 giờ nuôi cấy, ta sờ vào thấy nắp cao su cứng và phồng lên  chứng tỏ có khí sinh ra.

- Nhìn vào dung dịch nuôi cấy cho thấy đục và có những mảnh trôi nổi trong dung dịch  chứng tỏ đã có sự phát triển của vi khuẩn một cách mạnh mẽ.

Hình 3.1. Bình serum trước và sau khi nuôi cấy (48h)

- Hơn nữa, dựa vào kết quả đo OD và đo lượng khí hydro bằng máy GC, nhận thấy chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359 đã sinh trưởng tốt và sinh ra khí hydro.

38

Hình 3.2. Giá trị phần trăm số mol của hydro đo được khi nuôi cấy chủng vi khuẩn DSM 4359 với cơ chất là glucose tại những thời điểm là 24h, 32h, 40h và 48h thu được nhờ máy đo GC.

Nhìn chung, sự sinh trưởng của các vi sinh vật kị khí thường rất chậm, tuy nhiêm dựa vào giá trị OD có thể thấy, vi khuẩn này đã sinh trưởng tốt trong điệu kiện nhiệt độ cao và kị khí bắt buộc.

3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đơn giản đến sự sản sinh hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359

Ảnh hưởng của nồng độ các cơ chất đơn giản đến sự sản sinh hydro và khả năng tiêu thụ cơ chất của chủng vi khuẩn nghiên cứu được thực hiện và thu được kết quả trên Bảng 3.1. Ở đây, dải nồng độ của các cơ chất glucose và xylose lần lượt là là 3, 4, 5, 6, 7 g/L đã được thiết lập.

39

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các nồng độ cơ chất khác nhau đến hàm lượng hydro Nồng độ

(g/L)

Lượng hydro sinh ra với cơ chất glucose (mmol/L)

Lượng hydro sinh ra với cơ chất xylose (mmol/L)

3 17.01 16.73

4 17.51 17.75

5 19.68 20.01

6 19.60 19.07

7 17.20 16.52

Có thể thấy: hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các cơ chất glucose, xylose đều là 5g/L, với hàm lượng lần lượt là: 19.68 và 20.01(mmol/L).

Như vậy, khả năng sản sinh hydro của chủng T. neapolitana là tốt nhất khi nuôi cấy với nồng độ cơ chất là 5g/L. Đặc biệt là hàm lượng hydro thu được ở cơ chất glucose và xylose lại tương đối bằng nhau. Thông thường các vi sinh vật thường ưa sử dụng glucose, chất này sẽ trực tiếp được sử dụng để tạo ra năng lượng cũng như tạo thành sản phẩm mong muốn dựa vào đặc tính của từng vi sinh vật.

Tuy nhiên, ở đây chủng vi khuẩn này lại có thể sử dụng tốt cả xylose. Đây được coi là một trong những đặc điểm sinh học lý thú của vi khuẩn này.

3.1.2.1. Sự tiêu dùng glucose trong quá trình tạo hydro

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của glucose đến sự phát triển và khả năng sinh hydro của chủng T. neapolitana, có kết quả như sau:

40

Bảng 3.2: Sự tiêu thụ glucose trong quá trình phát triển và tạo sinh hydro của chủng T. neapolitana

Thời gian (h)

OD600 pH môi trường

Sản lƣợng H2 (mmol/L)

Acid acetic (mmol/L)

Glucose (mmol/L)

Acid lactic (mmol/L)

6 0.09 7.3 2.5 1.1 32 0

12 0.17 7 8.2 2.4 27 0

18 0.23 6.9 13.4 3.7 21.6 0.05

24 0.3 6.7 16.1 5.9 19.1 0.08

30 0.36 6.4 19.2 7.3 15 0.1

36 0.38 6.3 21.5 10.2 14.2 0.8

42 0.34 6.1 22.3 12.6 13.3 1.1

48 0.33 5.8 22.5 14.5 12.7 1.3

Sự phát triển của tế bào mạnh nhất tại thời điểm 36h, pH giảm dần liên tục từ 7.5 xuống 5.8 sau 48h nuôi cấy. Điều này đã ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào và khiến cho sự phát triển của tế bào giảm, kéo theo sự giảm lượng H2 sinh ra.

Hình 3.3. Sự tiêu thụ glucose trong quá trình sinh trưởng và tạo thành hydro và các acid hữu cơ

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 5 10 15 20 25

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54

Sản lượng hydro (mmol/L)

Thời gian (h)

Sản lượng H2 (mmol/L) Acid lactic (mmol/L) Acid acetic (mmol/l) Glucose (mmol/L)

Glucose,acid acetic, acid lactic (mmol/LL)

41

Hình 3.3 mô tả lượng sản phẩm phụ tạo thành và lượng cơ chất còn lại trong bình nuôi cấy giảm dần theo thời gian chứng tỏ được sự tiêu thụ cơ chất tăng dần theo thời gian của vi sinh vật (từ 32 đến 12 mmol/L) sau 48h nuôi cấy.

Sự hình thành acid acetic tương đồng với sự hình thành H2 và đạt giá trị cao nhất là 14.5mmol/L tại 48h, còn acid lactic thì hình thành muộn hơn (khoảng 30h mới xuất hiện). Lượng hydro thu được khá cao: 22.3mmol/L tại thời điểm 42h.

Trong một nghiên cứu trước đấy của S. Van Ooteghem và cộng sự (2001) đã chỉ ra rằng khi nuôi cấy chủng này với cơ chất glucose nhưng có sự xuất hiện của oxy thì lượng hydro thu được đạt 10.25- 12.30 (mmol/L), thấp hơn nhiều so với việc sử dụng glucose làm cơ chất nhưng nuôi cấy trong điều kiện kị khí hoàn toàn.

Trong một nghiên cứu của Martina Cappelletti, Giacomo Bucchi, Jocelia De Sousa Mendes, Andrea Alberini, Stefano Fedi, Lorenzo Bertin cand ario Frascari (2012) đã thực hiện nghiên cứu sự tạo thành hydro của 4 chủng Thermotoga đó là T.

neapolitana, T. naphtophila, T. maritime và T. petrophila với cơ chất là glucose thì lượng hydro tạo ra lần lượt là 2mmol/L; 0.5mmol/L; 0.8mmol/L và 1mmol/L. Điều này chứng tỏ rằng nuôi chủng T. neapolitana với glucose sẽ cho hiệu suất cao nhất.

3.1.2.2. Sự tiêu thụ xylose trong quá trình sinh trưởng

Bảng 3.3: Sự tiêu thụ xylose đến trong quá trình sinh trưởng và tạo hydro của chủng T. neapolitana

Thời gian (h)

OD600 pH Sản lƣợng H2 (mmol/L)

Acid acetic (mmol/L)

Xylose (mmol/l)

Acid lactic (mmol/L)

6 0.04 7.3 2.5 2 22 0

12 0.12 7.2 9.5 2.7 17 0

18 0.21 7.1 13.4 4 13 0.05

24 0.28 6.8 16.7 5.3 12.5 0.1

30 0.31 6.5 19 7.6 11.3 1.2

36 0.305 6.3 21.1 10.6 10.8 1.9

42 0.295 5.9 22.1 13.7 9.7 2.05

48 0.29 5.7 22 14.4 8.5 2.07

42

Trong 48h nuôi cấy, tốc độ phát triển của tế bào tăng dần, đạt giá trị cao nhất OD600 = 0.31 tại thời điểm 30h và sau đó giảm nhẹ còn 0.29 tại 48h. Trong quá trình này, giá trị pH cũng giảm dần từ 7.3 xuống còn 5.7, tương tự như khi nuôi cấy chủng vi khuẩn này với cơ chất glucose.

Tương tự như với cơ chất glucose, khi sử dụng xylose làm cơ chất thì cũng thu được sản lượng hydro và lượng acid acetic cao nhất tương đương với những đại lượng này khi sử dụng cơ chất glucose là 21.1mmol/L và 13.7mmol/L vào khoảng 36h và 42h nuôi cấy. Tuy nhiên, lượng acid lactic được tạo ra sớm hơn vào khoảng 24h nuôi cấy.

Trong nghiên cứu trước đó, Suellen A.Van ooteghem và cộng cùng với Stephen K.Beer và Paul Yue cũng thực hiện nghiên cứu tương tự với Thermotoga neapolitana nhưng mà sử dụng cơ chất khác. Kết quả cho thấy, với cơ chất tinh bột tan thì hydro sinh ra là 12.30- 14.35 (mmol/L) với cellulose chỉ đạt 2.05- 4.10 (mmol/L) với cellobiose là khoảng 12.30 (mmol/L) còn với dextrose là hơn 10.25 (mmol/L), thấp hơn rất nhiều khi sử dụng glucose và xylose làm cơ chất.

Từ đó, cho thấy chủng vi khuẩn T. neapolitana DSM 4359 có khả năng sử dụng cả 2 loại đường là glucose và xylose là ngang nhau và hiệu suất sinh hydro khi sử dụng hai loại đường này là khá cao. Đây là một lợi thế lớn của chủng vi khuẩn này, vì điều đó cho phép ta có thể sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu thô trong việc nuôi cấy.

3.1.3. Khảo sát một số nguồn nitơ phổ biến cho sự sản xuất hydro sinh học từ chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt DSM 4359 và đánh giá khả năng sinh hydro

Nitơ là thành phần rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Trong điều kiện quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sự phát triển và khả năng sinh hydro của chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359 thông qua khả năng sử dụng các nguồn nitơ như cao nấm men, NH4 NO3 hay peptone ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra một nồng độ thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn này đạt sản lượng hydro cao nhất và tiết kiệm nguyên vật liệu nhất có thể.

Dựa vào những tài liệu và các nghiên cứu trước về môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359 [4, 8, 9], chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nguồn nitơ ban đầu tới khả năng sinh hydro ở các nồng độ cụ thể là 1g/L; 2g/L; 3g/L; 4g/L và 5g/L với mỗi loại nguồn

43

nitơ là cao nấm men, NH4 NO3 và peptone theo phương pháp lên men tối và thu được kết quả như sau.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ cơ chất khác nhau đến hàm lượng hydro Nồng độ

cơ chất (g/L)

Hàm lƣợng hydro (mmol/L) Cao nấm men Peptone NH4NO3

1 17.02 16.73 9.96

2 20.01 19.27 13.16

3 19.35 19.07 11.32

4 17.83 17.63 10.66

5 17.30 16.52 9.92

Dựa vào Bảng 3.4 cho thấy: khi nồng độ của các nguồn nitơ tăng từ 1 đến 2 g/l thì tỉ lệ phần trăm hydro thu được cũng tăng lên nhanh chóng, từ 17.02 lên 20.01 (mmol/L) (khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men), từ 16.73 lên 19.27 (mmol/L) (khi sử dụng nguồn nitơ là peptone) và tỉ lệ này tăng từ 9.96 lên 13.16 (mmol/L) (khi sử dụng nguồn nitơ là NH4NO3). Nhưng khi nồng độ của các nguồn nitơ tăng từ 3 đến 5g/L thì lại thấy có sự giảm nhanh của tỉ lệ hàm lượng hydro chỉ còn 17.30;

16.52; 9.92 (mmol/L) lần lượt với các nguồn nitơ cao nấm men, peptone, và NH4

NO3.

Do đó, có thể thấy rằng hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các nguồn nitơ là cao nấm men, peptone và NH4 NO3 đều là 2g/L, với hàm lượng lần lượt là: 20.01; 19.27; 13.16 (mmol/L).

Như vậy, khả năng sản sinh hydro của chủng DSM 4359 là tốt nhất khi nuôi cấy với nồng độ nguồn nitơ là 2 g/L. Tuy nhiên, hàm lượng hydro thu được khi nuôi cấy với nguồn nitơ là cao nấm men và peptone trên nguồn cơ chất glucose lại tương đối bằng nhau (lần lượt là 20.01 và 19.27 mmol/L) và cao hơn nhiều so với tỉ lệ còn lại khi sử dụng nguồn nitơ là NH4 NO3 (13.16 mmol/L) Những kết quả thu được này đúng với những nghiên cứu đã được thực hiện trước đó của Chieh-Lun Cheng và cs 2011 và Duu Jong Lee và cs 2011. Điều này có thể được giải thích là do cao nấm

44

men và peptone là những nguồn nitơ hữu cơ, dễ được vi khuẩn sử dụng, còn NH4

NO3 có bản chất là muối vô cơ. Hơn nữa, trong cao nấm men, tổng hàm lượng amino-nitrogen là khoảng 5%, cao hơn so với hàm lượng này ở peptone (khoảng 3%), nên khi sử dụng cao nấm men là nguồn nitơ cho thấy tỉ lệ hàm lượng hydro thu được cao hơn so với khi sử dụng peptone là nguồn nitơ.

Chúng tôi đã đi đến một số kết luận qua nghiên cứu trên:

- Nồng độ nguồn nitơ ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sản lượng hydro thu được. Từ các kết quả ở trên, cho thấy ở nồng độ nguồn nitơ thấp (1g/L) thì sự phát triển của vi khuẩn bị hạn chế, dẫn đến sản lượng hydro thu được không cao. Còn ở nồng độ nguồn nitơ cao (5g/L) thì lại ức chế sự phát triển của vi khuẩn, do đó, lượng hydro thu được cũng không cao.

- Nồng độ nguồn nitơ 2g/L là tối ưu cho sự sản sinh hydro của chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM 4359.

- Đối với cùng một nồng độ nguồn nitơ thì sự phát triển và sản sinh hydro của chủng DSM 4359 trên nguồn nitơ là cao nấm men và peptone cao hơn hẳn so với sản lượng đó khi sử dụng NH4 NO3 làm nguồn nitơ. Tuy nhiên, sản lượng hydro thu được với sự sử dụng cao nấm men là cao hơn. Do đó, cao nấm men đã được chọn để sử dụng làm nguồn nitơ chính trong các nghiên cứu tiếp theo.