II .NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp thực nghiệm
Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn CN Xenluloza &
Giấy, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylô.
2.2.1.Chuẩn bị chế phẩm sinh học
Chế phẩm sinh học hòa tan trong nước sạch, khuấy đều trong 30 phút trước khi sử dụng. Tỉ lệ pha được xác định tùy theo mục tiêu của từng thực nghiệm.
2.2.2. Xử lý dăm mảnh với chế phẩm sinh học trong phòng thí nghiệm
Xử lý dăm mảnh được tiến hành trong các thùng nhựa có nắp. Mỗi lần xử lý được tiến hành với 1,5 kg dăm mảnh khô. Dung dịch chế phẩm sinh học được phun đều vào dăm mảnh, sau đó đậy nắp thùng và lắc nhẹ cho dung dịch thấm đều bề mặt dăm mảnh, rồi chuyển sang một rổ lưới cho thoát nước hết. Sau đó dăm mảnh ẩm được bảo quản trong túi ni lông để hở miệng ở nhiệt độ phòng, thường xuyên đảo trộn.
Mức dùng (nồng độ) chế phẩm sinh học, thời gian bảo quản được điều chỉnh tùy theo mục tiêu từng thực nghiệm. Kết thúc thời gian xử lý, mảnh gỗ được đem phơi khô, lấy mẫu ngẩu nhiên để chế biến thành dạng bột gỗ cho phân tích hàm lượng các chất trích ly, phần còn lại được sử dụng cho nấu bột giấy theo phương pháp nấu sunfat và xác định hiệu suất, các tính chất cơ lý học của bột thu được.
Các mẫu đối chứng với khối lượng tương đương, được xử lý tương tự, thay dung dịch nấm bằng nước.
2.2.3. Xử lý dăm mảnh với chế phẩm sinh học tại bãi chứa dăm mảnh của Tổng Công ty Giấy Việt Nam
Sân bãi cho nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học để xử lý dăm mảnh được bố trí trên khuôn viên bãi chứa nguyên liệu của Phân xưởng Nguyên liệu – Tổng Công ty Giấy Việt Nam, với diện tích khoảng 200 m2, nền bê tông, được kết nối với hệ thống cung cấp điện, nước phục vụ cho quá trình nghiên cứu.
Chế phẩm sinh học được chuẩn bị trong thùng chứa dung tích 80 lít, khuấy đều dung dịch cho phân tán trong thời gian 30 phút trước khi phun, rồi pha loãng bằng nước để tạo thành dung dịch có nồng độ 0,05% và sử dụng cho xử lý dăm mảnh.
Dung dịch được đấu nối với thiết bị phun áp lực 3,0 kW/220V, lưu lượng nước 13 lít/phút, dạng phun tia với lưu lượng ổn định.
Dăm mảnh nguyên liệu sau khi được phối trộn theo tỷ lệ yêu cầu, được vận chuyển bằng máy xúc lật đến bãi chứa, khối lượng mỗi gầu xúc được ước tính khoảng 2 tấn. Tại vị trí được xác định, dăm mảnh được đổ từ từ xuống bãi mảnh trong thời
gian khoảng 5 phút nhằm đảm bảo quá trình phun chế phẩm sinh học được đồng đều.
Song song với quá trình dăm mảnh được đổ bằng gầu xúc, chế phẩm sinh học được phun đều bằng thiết bị phun áp lực. Lượng dịch phun được tính toán và ước chừng theo thực tế để đảm bảo sự đồng đều.
Sau khi được phối trộn đều chế phẩm sinh học, nguyên liệu được gom thành đống dạng hình chóp, để thoát nước tự nhiên và tiến hành bảo quản trong thời gian tùy thuộc vào mục tiêu của từng thực nghiệm.
Mẫu đối chứng với khối lượng tương đương cũng được xử lý tương tự , thay dung dịch nấm bằng nước sạch.
Kết thúc thời gian bảo quản, tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên ở 5 vị trí khác nhau của đống dăm mảnh (1 điểm ở đỉnh, 02 điểm ở giữa và 02 điểm ở chân đống), ở có độ sâu khoảng 20 cm so với bề mặt. Tổng khối lượng mẫu khoảng 5 kg, được phơi khô, rồi lấy mẫu ngẩu nhiên để chế biến thành dạng bột gỗ cho phân tích hàm lượng các chất trích ly, phần còn lại được sử dụng cho nấu bột giấy theo phương pháp nấu sunfat và xác định hiệu suất, các tính chất cơ lý học của bột thu được.
2.2.4. Nấu bột giấy
Nấu bột giấy được tiến hành theo phương pháp sunfat, bằng hệ thống nấu bột thực nghiệm có nồi nấu dung tích 4,5 lít.
Điều kiện công nghệ (mức dùng hóa chất, nhiệt độ và thời gian nấu) được lựa chọn tương tự như Quy trình công nghệ nấu bột đang áp dụng tại Tổng Công ty Giấy Việt Nam. Thời gian tăng ôn và thời gian bảo ôn được kéo dài hơn, do đặc điểm của thiết bị nấu thực nghiệm tại Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylô. Thông số của công đoạn nấu bột như sau:
- Tổng mức dùng kiềm, (% NaOH) : 20 - Độ sunphua, (% theo tổng kiềm) : 25 - Tỷ dịch, (tỷ lệ rắn/ lỏng) : 1/4 - Thời gian tăng ôn, (phút) : 90 - Thời gian bảo ôn, (phút) : 150 - Nhiệt độ bảo ôn, (oC) : 170
Bột giấy sau nấu được rửa trên các lưới rửa với số mắt lưới là 40 mesh và 100 mesh. Bột giấy hợp cách qua lưới 40 mesh được vắt khô, sấy và phân tích hiệu suất, trị số Kappa, tàn kiềm và hàm lượng các chất trích ly trong bột.
2.2.5. Chuẩn bị nguyên liệu dăm mảnh cho phân tích
Các mẫu dăm mảnh trước và sau xử lý được chẻ mảnh và nghiền thu bột gỗ có kích cỡ được lấy trên sàng có mắt sàng 0,25 mm và dưới sàng có mắt sàng 0,5 mm.
Mẫu bột gỗ được để đồng ẩm trước khi đem đi phân tích.
2.2.6. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Độ ẩm nguyên liệu, các sản phẩm trung gian và sản phẩm phân tích được xác định theo tiêu chuẩn TAPPI T207.
Cân khoảng 1±0,1g bột gỗ khô gió, chính xác đến 0,1mg (cân trực tiếp bằng chén cân có nắp đã được sấy ở 105oC 3 đến khối lượng không đổi). Cân hai mẫu đồng thời tiến hành song song. Đưa chén cùng bột gỗ vào sấy trong tủ sấy và sấy ở 105
3oC trong vòng 3 giờ. Kết thúc thời gian trên, đậy nắp chén lại và cẩn thận lấy nhanh ra khỏi tủ, cho vào bình hút ẩm, làm nguội trong bình hút ẩm trong vòng 10-20 phút, sau đó cân. Thực nghiệm lặp lại 3-4 lần tới khi thu được khối lượng giữa các lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 0,002g.
Độ ẩm tương đối của gỗ được tính theo công thức:
W = m m m m
1 2
1 . 100%;
Trong đó: m - khối lượng chén cân (g);
m1 - khối lượng chén cân và bột gỗ trước khi sấy (g);
m2 - khối lượng chén và bột gỗ sau khi sấy (g).
Sai số giữa kết quả (độ ẩm) của hai lần xác định song song không được vượt quá 0,5%. Độ ẩm tương đối của bột gỗ là kết quả trung bình cộng của hai mẫu song song.
Hệ số khô của bột gỗ được tính theo công thức sau:
K= m m
m W m
1 2
100
100 ;
2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng các chất trích ly
Hàm lượng các chất trích ly (nhựa) được xác định theo phương pháp tiêu chuẩn hóa TAPPI T280.
Cân một lượng bột gỗ khô gió tương đương 2,0±0,1 g bột khô tuyệt đối chính xác tới 0,1 mg. Cân hai mẫu để tiến hành song song. Gói cẩn thận bằng giấy lọc thành 1 gói hình trụ, buộc chặt hai đầu bằng sợi chỉ trắng, sao cho đường kính của hình trụ nhỏ hơn đường kính trong của ống trích ly (để có thể đặt vào và lấy ra dễ dàng), còn chiều dài điều chỉnh sao cho khi đặt vào ống trích ly, đầu trên của nó phải cách mức trên của ống xifon khoảng 1,5 cm. Rót vào bình cầu dung tích 250 ml khoảng 200 ml dung môi.
Lắp bộ trích ly theo sơ đồ và đặt vào bể cách thủy. Nhiệt độ của bể được điều chỉnh bằng nhiệt độ sôi của dung môi. Để điều chỉnh lượng dung môi hợp lý, đơn giản cho công đoạn chưng bốc dung môi sau đó, thường nó được rót vào bình qua sinh hàn rồi vào ống trích ly, sao cho lượng dung môi đủ cho 2-3 lần tự rót từ ống trích ly sang bình.
Quá trình trích ly kéo dài trong vòng 5-6 giờ kể từ khi dung môi bắt đầu tự rót từ ống xifon xuống bình chưng. Điều chỉnh nhiệt độ của bếp sao cho cứ 10 phút dung môi lại tự rót 1 lần từ ống trích ly sang bình qua ống xifon, hay khoảng 30-35 lần rót.
Sau đó ngừng gia nhiệt, bổ sung một ít nước lạnh vào bể đun để tránh dung môi tiếp tục bay hơi và tháo dỡ bộ trích ly. Sấy dung dịch các chất trích ly bằng Na2SO4 khan để loại nước (cho vài thìa nhỏ Na2SO4 khan vào bình chứa dung dịch các chất trích ly và để qua đêm).
Sau đó, dùng phễu lọc để lọc và chuyển dung dịch các chất trích ly đã sấy sang một bình cầu nhỏ loại 100 ml đã sấy khô tới khối lượng không đổi, tráng bình bằng dung môi nguyên chất, chưng cất dung môi trên bộ cất quay chân không ở 60oC, rồi sấy chân không trong bình hút ẩm chân không với chất hút ẩm là CaCl2 và một ít NaOH khan tới khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối lượng.
Hàm lượng các chất trích ly (E %) so với nguyên liệu khô tuyệt đối, được tính theo công thức:
E =
Trong đó: m1 - khối lượng bình chứa các chất trích ly (g);
m - khối lượng bình không (g);
g- khối lượng mẫu bột gỗ khô tuyệt đối (g);
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,05%.
) 100 ( 1
g
m m
2.2.8. Phương pháp phân tích thành phần các chất dễ bay hơi của chất trích ly từ gỗ
Các chất trích ly được hòa tan trong etanol tinh khiết, rồi được phân tích bằng máy sắc ký khí Trace - GC RGA - Finnigan – USA, Detector MS loại bẫy ion, ion trap, dải quét là 50-500 mass, nhiệt độ detector 200oC, điện thế 70eV, chế độ quét toàn dải (full scale), thư viện cấu trúc NIST, tại Phòng thí nghiệm Lọc Hoá dầu và Vật liệu Xúc tác, Viện kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
2.2.9. Phương pháp xác định trị số Kappa của bột giấy
Cân một lượng bột khô gió đã biết độ ẩm và tính lượng bột khô tuyệt đối tương đương chính xác tới 0,001g, sao cho khi tiến hành phản ứng lượng tiêu hao KMnO4
xấp xỉ bằng 50% tổng lượng sử dụng cho phản ứng (trong khoảng 0,5 0,7g bột khô tuyệt đối vừa nấu). Xé thật nhỏ bột và cho vào cốc phản ứng dung tích 1 lít, bổ sung 250 ml nước cất và ngâm trong vòng vài giờ. Sau đó đánh tơi bột bằng máy đánh tơi (máy khuấy đũa trục đứng) cho tới khi xơ sợi bị phân tán hoàn toàn (quan sát không còn vón cục hay bó sợi). Chuyển bột đã được đánh tơi vào cốc phản ứng dung tích 1 lít và dùng 140 ml nước cất để rửa phần bột dính trên bộ phận đánh tơi vào cốc phản ứng.
Đặt cốc phản ứng chứa bột lên máy khuấy từ gia nhiệt, điều chỉnh tốc độ khuấy sao cho miệng của xoáy nước có đường kính khoảng 2,5 cm.
Dùng pipet hoặc ống đong lấy 50 ml dung dịch kali permanganat 0,1N và 50 ml dung dịch H2SO4 4N (2M) cho vào cốc thủy tinh dung tích 250 ml. Khuấy trộn đều hỗn hợp phản ứng. Chuẩn bị đồng hồ bấm giây. Đổ nhanh hỗn hợp phản ứng vào cốc phản ứng chứa bột, tráng cốc nhỏ bằng 10 ml nước cất và bổ sung nước sao cho tổng lượng chất lỏng trong cốc phản ứng đủ 500 ml. Đồng thời với khi đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc chứa bột, bấm đồng hồ và tính thời gian chính xác sau 10 phút, dùng ống đong bổ sung 20 ml dung dịch KI 0,1N. Sau đó chuẩn iôt tự do sinh ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N tới khi dung dịch có mầu vàng rơm, sau đó bổ sung vài giọt chỉ thị tinh bột và tiếp tục chuẩn độ tới khi dung dịch mất mầu.
Tiến hành làm thí nghiệm trắng, tức làm như trên nhưng không có bột giấy.
Ngoài ra dung dịch KI có thể bổ sung ngay vào cốc phản ứng chứ không cần đợi 10 phút sau khi bổ sung hỗn hợp KMnO4 và H2SO4.
Trị số Kappa của bột được tính theo công thức sau:
K = g f p.
trong đó:
p = 0,1 ).
(ba N
là lượng dung dịch KMnO4 0,1N tiêu hao cho mẫu thực nghiệm;
f – Hệ số hiệu chỉnh tới 50% lượng KMnO4 tiêu hao, phụ thuộc vào trị số p (bảng dưới);
g: Khối lượng bột khô tuyệt đối (g);
b – Lượng dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu hao cho phản ứng trong thực nghiệm mẫu đối chứng (ml);
a – Lượng dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu hao cho phản ứng trong thực nghiệm có bột giấy (ml);
N - Nồng độ của dung dịch Na2S2O3 (0,1N);
0,1: Nồng độ của dung dịch KMnO4.
Tiến hành xác định hai lần, nếu trị số Kappa lớn hơn 20 thì sai số phải nằm trong khoảng ±1%. Nếu sai số vượt quá 2% thì tiến hành thêm lần ba và tính toán lại giá trị trung bình cũng như sai số.
2.2.10. Phương pháp xác định hoạt lực enzyme a, Phương pháp xác định hoạt tính lignin peroxidase
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hóa O-Dianisidine biểu hiện bằng sự gia tăng hấp thụ ở bước sóng 460 nm.
Một đơn vị hoạt độ Lignin peroxidase là lượng enzyme cần thiết để oxy hóa 1μM O-Dianisidine trong 1 phút hấp thụ bước sóng 460 nm ở 30C.
Phản ứng bắt đầu khi cho 200 àl H2O2 vào mẫu thớ nghiệm, cỏc thành phần phản ứng được voltex trong 1 phút và đo ngay ở bước sóng 460 nm.
Bảng 2.2 Tỷ lệ các thành phần trong phương pháp xác định hoạt tính lignin peroxidase
STT Thành phần Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm
1 Đệm phosphat pH 7,0 600 àl 400 àl
2 Dịch enzyme 200 àl 200 àl
3 o-dianisidine 0,04% 200 àl 200 àl
4 H2O2 50 mM 0 200 àl
Hoạt tính lignin peroxidase được xác định bằng công thức sau:
( )
(nkat/L) Trong đó: t: thời gian voltex (phút)
ɛ : Hệ số hấp phụ = 29400 M-1cm-1 V : Tổng số ml phản ứng (ml)
v : lượng dịch enzyme phản ứng (ml)
b, Phương pháp xác định hoạt tính laccase [Cho NS., Pashenova N., Hop PTB., Leonowicz A. (2003]
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá syringaldazin thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bước sóng 525nm. Dung dịch phản ứng bao gồm đệm citrate-phosphat (pH 5,2) và dịch enzyme. Phản ứng diễn ra ở 30oC khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch Syringaldazin. Đọc giá trị hấp thụ ánh sáng.
Một đơn vị hoạt độ laccase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để oxy húa 1 àmol syringaldazin trong một phỳt ở điều kiện phản ứng.
Bảng 2.3 Tỷ lệ các thành phần trong phương pháp xác định hoạt tính laccase STT Thành phần Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm
1 Đệm citrate/phosphat pH 5,2 700 àl 600 àl
2 Dịch enzyme 300 àl 300 àl
3 Syringaldazin 0 100 àl
Mẫu phản ứng được đưa vào cuvete có gắn parafilm và mix đều 3-5 lần.
Mẫu phản ứng được đo sau đó 1 phút ở bước sóng 525 nm.
Công thức tính: Hoạt tính = ( )
(nkat/L) Trong đó: t: thời gian phản ứng (giây);
V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml);
v: thể tích dịch enzyme thô (ml);
: hệ số hấp thụ (65000 M-1 cm-1).
Ta có công thức chuyển đổi: 1 U/L = 16,67 nkat/L c, Phương pháp xác định hoạt tính lipaza
Hoạt tính lipaza được xác định theo phương pháp chuẩn độ liên tục.
Cách tiến hành: Chuẩn bị dịch cơ chất: dung dịch 0,2 – 5% dầu oliu và 1% Gum arabic trong nước, đánh tan thành huyền phù trong 5-10 phút. Sau đó, rót 20ml dịch cơ chất cốc thủy tinh trên máy chuẩn độ tự động, bổ sung thêm 370 ml CaCl2 22% và chỉnh đến pH 8,0. Ổn định pH, nhiệt độ và tiến hành đo.
- Xác định độ tự thủy phân của dung dịch cơ chất bằng thể tích dung dịch NaOH 10 mM (àl) cần thờm vào 20 ml hỗn hợp cơ chất núi trờn trong 10 phỳt để duy trì pH tại 8,0.
- Thờm thể tớch V (àl) enzyme vào dung dịch cơ chất sau khi tiến hành đo độ tự thủy phõn. Ghi lại thể tớch NaOH 10 mM (àl) cần dựng trong 10 phỳt để duy trỡ pH dung dịch tại 8,0.
Kết quả: Một đơn vị hoạt tính của enzyme lipaza được xác định bằng lượng Enzyme cần thiết để giải phúng 1 àmol axit bộo trong 10 phỳt ở điều kiện thớ nghiệm theo công thức sau:
Ulipaza = [(VE – V0) *10]/ Ve (U/ml) Trong đó:
- VE : Thể tớch NaOH 10mM (àl) cần dựng để duy trỡ pH tại 8,0 sau khi bổ sung enzyme vào cơ chất.
- Vo : Thể tớch NaOH 10mM (àl) cần dựng để duy trỡ pH tại 8,0 trước khi bổ sung enzyme vào cơ chất.
- Ve : Thể tớch enzyme bổ sung (àl).
- 10: Hệ số chuyển nồng độ