7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp
2.5 Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí nhằm mục đích nghiên cứu khảo sát thực nghiệm để tìm ra tác nhân tiền xử lý, nồng độ tác nhân, thời gian tiền xử lý tối ưu quá trình tiền xử lý hướng đến xây dựng công nghệ chuyển hóa gỗ (cao su) thành bioethanol bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) sử dụng Acremomiumn cellulase và Saccharomyces Cerevisiae ở quy mô phòng thí nghiệm. Các thí nghiệm bao gồm:
- Khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men.
- Phân tích thành phần mùn cưa.
- Khảo sát kích thước hạt mùn cưa.
- Khảo sát hiệu quả tác nhân tiền xử lý H2SO4. - Khảo sát hiệu quả tác nhân tiền xử lý NaOH.
- Khảo sát hiệu quả thời gian tiền xử lý của từng tác nhân.
- Khảo sát kết hợp cả 2 tác nhân tiền xử lý.
- Tiến hành lên men kiểm chứng hiệu quả tiền xử lý.
36
2.5.2 Khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men
2.5.2.1 Phương pháp cấy giống và giữ giống nấm men
Chuẩn bị môi trường SDA có thành phần như trong Bảng 2.3, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị trước đó. Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.
Giống nấm men sau khi được cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ. Sau đó đặt các ống nghiệm vào tủ lạnh để bảo quản giống, phục vụ cho quá trình lên men.
2.5.2.2 Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối và hoạt lực giống. Sau khi nấm men phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng, cấy ria vào đĩa petri chứa môi trường SDA, ủ ở nhiệt độ phòng. Tất cả các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống cấp 1: lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường SDB (thành phần môi trường được đưa ra trong bảng 2.2), ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: chuyển ống nghiệm sang chai chứa 90 mL môi trường SDB nuôi cấy lắc ở nhiệt độ thường trong 24 giờ.
2.5.2.3 Phương pháp đếm nấm men
Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống.Tiến hành:
- Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thấp phân thích hợp: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.
- Trải mẫu: dựng micropipette hỳt 20 àL dịch mẫu đó pha loóng ở nồng độ thớch hợp cho vào môi trường đĩa thạch. Sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Tất cả các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
37
Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đem tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250 để tính toán.
2.5.2.4 Khảo sát đường cong tăng trưởng nấm men
Dịch nấm men sau khi được nuôi cấy trong môi trường SDB chuyển sang môi trường SDB mới và tiến hành khảo sát mật độ tế bào theo thời gian trong vòng 48 giờ.
2.5.3 Phân tích thành phần mùn cưa
2.5.3.1 Phân tích thành phần lignin trong mùn cưa
Phương pháp xác định các thành phần carbohydrate, lignin và tro trong mẫu nguyên liệu là biomass dựa trên bài báo cáo nghiên cứu của RISE innventia AB (viện nghiên cứu Thụy Điển). Trình tự thực hiện các bước như sau:
a) Chuẩn bị nguyên liệu thí nghiệm
-Cân một phần mẫu thử (100 ± 10) mg chính xác đến 0,1 mg cho vào cốc thuỷ tinh có thể tích tối thiểu là 150 mL.
b) Thủy phân
- Đối với mẫu thí nghiệm trong cốc, dùng pipet thêm chính xác 1 mL H2SO4 72%.
- Khuấy mẫu trong cốc bằng một thanh thủy tinh cho đến khi mẫuu bắt đầu hòa tan.
- Đặt cốc vào nồi cách thủy (30 ± 0.5)˚C trong 1 h.
- Khuấy đều. Thêm 28 mL nước.
- Đậy cốc bằng giấy nhôm và đặt vào nồi hấp ở (120 ± 5) ˚C trong 1 h.
- Để cốc và các chất trong cốc nguội đến khoảng 80˚C.
c) Xác định hàm lượng không tan trong acid (AIR)
- Lọc mẫu một đến hai lần bằng cốc lọc trong khi còn nóng.
- Dịch lọc được đựng trong beaker (để xác định hàm lượng lignin tan trong acid).
- Rửa phần bã bằng nước nóng cho đến khi không còn acid, kiểm tra bằng giấy pH.
- Đem cốc lọc có chứa bã sấy ở nhiệt độ 105 độ qua đêm, để nhiệt độ hạ xuống trong bình hút ẩm và xác định độ giảm của khối lượng (phần không tan trong acid)
d) Xác định lignin tan trong acid (ASL)
38
- Xác định hàm lượng lignin tan trong acid trong dịch lọc đầu tiên bằng quang phổ với bước sóng 205 nm. Pha loãng dịch lọc cho đến khi độ hấp thu nằm trong 0,2 – 0,7.
2.5.3.2 Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hoff
Nguyên tắc này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử Anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến đậm nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV – Vis.
Dựa vào đồ thị đưởng chuẩn giữa cellulose với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp mạnh nhất ở bước sóng 630 nm.
Cách tiến hành:
- Cân 2g mẫu, cho vào 20mL dung dịch H2SO4 5%, đun trong 2 tiếng để tiến hành phá mẫu. Sau đó lọc rửa, bỏ bã, thu phần dịch để tiến hành đo cellulose.
- Cho 0,5 mL dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm và thêm 5 mL thuốc thử Anthrone, chuẩn bị mẫu đối chứng là dung dịch H2SO4 5% thay cho dung dịch mẫu.
- Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước sóng 630 nm.
- Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose theo OD suy ra hàm lượng cellulose trong mẫu.
2.5.3.3 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitro-Salicylic (DNS)
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitro – salicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định.
Cách tiến hành:
- Cho 3 mL dung dịch thu được vào ống nghiệm chứ 1 mL dung dịch DNS.
- Nung cách thủy hỗn hợp trong 15 phút.
- Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước sóng 540 nm.
- Dựa vào đồ thị đường chuẩn xác định được hàm lượng glucose.
39
2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tiền xử lý
Gỗ cần được nghiền càng nhỏ càng tốt. Mùn cưa sau khi đã nghiền nhỏ được phân tích trên hệ rây tiêu chuẩn để xác định tỉ lệ thành phần các kích thước hạt, tiến hành tiền xử lý thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của kích thước hạt. Sau đó, mùn cưa được tiền xử lý bằng các hóa chất ở những nồng độ khác nhau để so sánh tính hiệu quả trong việc loại bỏ lignin cũng như tối ưu nồng độ hóa chất thích hợp cho quá trình tiền xử lý.
Nghiên cứu tiến hành khảo sát tác nhân tiền xử lý NaOH và H2SO4 ở các nồng độ khác nhau để chọn ra tác nhân thích hợp cho quá trình thủy phân và lên men sau đó.
Hiệu suất của các tác nhân được tính bằng tỉ lệ giữa lignin và cellulose đã được loại bỏ so với tỉ lệ lignin và cellulose trong mẫu gỗ ban đầu.
2.5.4.1 Tiền xử lý bằng H2SO4
Cân 5g mẫu nguyên liệu cho vào erlen và ngâm trong 50 mL dung dịch H2SO4 ở các nồng độ 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau đó lấy phần dịch tiền xử lý đem đi xác định hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu theo phương pháp trình bày ở mục 2.5.3.1.
2.5.4.2 Tiền xử lý bằng NaOH
Cân 5g mẫu nguyên liệu cho vào erlen và ngâm trong 50 mL dung dịch NaOH ở các nồng độ 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau đó lấy phần dịch tiền xử lý đem đi xác định hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu theo phương pháp trình bày ở mục 2.5.3.1
2.5.4.3 Khảo sát thời gian tiền xử lý
Thực hiện các thí nghiệm với tác nhân NaOH ở nồng độ 1,5%, 2% và tác nhân H2SO4
ở nồng độ 2%, 2,5% với các thời gian khác nhau
Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu. Nội dung các thí nghiệm được trình bày trong các bảng
40
Bảng 2.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý với tác nhân NaOH 1,5%
Stt Lượng mẫu(g) Thể tích dịch NaOH 1,5% (mL) Thời gian(h)
1 5 50 4
2 5 50 8
3 5 50 12
4 5 50 16
5 5 50 20
6 5 50 24
Bảng 2.5 Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý với tác nhân NaOH 2%
Stt Lượng mẫu(g) Thể tích dịch NaOH 2% (mL) Thời gian(h)
1 5 50 4
2 5 50 8
3 5 50 12
4 5 50 16
5 5 50 20
6 5 50 24
Bảng 2.6 Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý với tác nhân H2SO4 2%
Stt Lượng mẫu(g) Thể tích dịch H2SO4 2% (mL) Thời gian(h)
1 5 50 4
2 5 50 8
3 5 50 12
4 5 50 16
5 5 50 20
6 5 50 24
41
Bảng 2.7 Thí nghiệm khảo sát thời gian tiền xử lý với tác nhân H2SO4 2,5%
Stt Lượng mẫu(g) Thể tích dịch H2SO4 2.5% (mL) Thời gian(h)
1 5 50 4
2 5 50 8
3 5 50 12
4 5 50 16
5 5 50 20
6 5 50 24
2.5.4.4 Khảo sát kết hợp 2 tác nhân tiền xử lý
Thí Nghiệm 1: tiến hành tiền xử lý lần 1 với NaOH 2% trong 24 giờ, lọc rửa, loại bỏ hoàn toàn tác nhân tiền xử lý, tiếp tục tiền xử lý lần 2 với H2SO4 2% trong 24 giờ.
Thí nghiệm 2: tiến hành tiền xử lý lần 1 với H2SO4 2% trong 24 giờ, lọc rửa, loại bỏ hoàn toàn tác nhân tiền xử lý, tiếp tục tiền xử lý lần 2 với NaOH 2% 24 giờ.
Đánh giá kết quả thí nghiệm thông qua hàm lượng lignin tách ra khỏi mẫu nguyên liệu ban đầu.
2.5.5 Tiến hành lên men kiểm chứng hiệu quả tiền xử lý
Chọn ra nồng độ tiền xử lý thích hợp nhất để tiến hành lên men. Các bước thực hiện được tiến hành như sau:
- Cân 5g mùn cưa gỗ cao su.
- Tiền xử lý với tác nhân thích hợp, tỉ lệ mẫu:dịch tiền xử lý (1:10).
- Trung hòa về pH 5,5, lọc rửa bã.
- Định mức bằng nước cất vào cho bằng thể tích dịch tiền xử lý ban đầu.
- Bổ sung bột bắp (5%), peptone (5%).
- Hấp tiệt trùng 121oC, 10 phút.
- Giống nấm men dạng dịch lỏng sẽ được ly tâm để tránh làm loãng dịch lên men.
- Bổ sung đồng thời enzyme (5%) và nấm men (5%) vào dịch lên men.
- Sau 48 tiếng, lấy mẫu đem đo cồn.
42
Hình 2.2. Quy trình lên men tạo bioethanol
43