Sơ đồ nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Thời gian lên men

Nhiệt độ pH

Tỷ lệ pha loãng

Tỷ lệ cấy giống

Đường bổ sung

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ bố trí nội dung nghiên cứu 3.3.2 Bố trí nội dung thí nghiệm

3.3.2.1 Xử lý giống

Từ giống gốc trên ống thạch nghiêng, dùng que cấy vòng cấy giống vào môi trường thạch MRS- agar trên đĩa petri để tiến hành quan sát đại thể sau 24- 48h ủ ở 37oC.

Quan sát vi thể và xác định Gram bằng phương pháp nhuộm Gram. Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 – 1938) phát minh ra từ năm 1884. Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: Vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, còn Khảo sát Lactobacillus acidophilus Xử lý nguyên liệu cam

Khảo sát điều kiện lên men

Đánh giá chất

lượng sản phẩm Bảo quản

sản phẩm

vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng [6].

Cho 1 ít giống vi sinh vật trên lame.

Cho crytal violet lên, bổ sung thêm 1 giọt iodine giúp crytal violet bám chặt vào màng tế bào vi sinh vật trong khoảng 30 giây.

Rửa nước → Rửa cồn → Rửa lại bằng nước → Cho thêm 1 giọt Basic Fuchsin

→ Rửa nước → Để khô tấm lame → Nhỏ 1 giọt dầu soi kính → Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100.

Cấy giống vào môi trường MRS lỏng nuôi cấy ở 37oC sau 24 – 48 giờ tiếp tục chuyển giống sang môi trường nhân giống là dịch quả pha loãng (tỉ lệ 1 nước quả : 5 nước) có bổ sung đường sucrose và cao nấm men ủ ở nhiệt độ 37oC sau 24 – 48 giờ tiến hành đếm số lượng tế bào bằng phương pháp trãi đĩa nhằm kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn trước khi tiến hành lên men.

3.3.2.2 Khảo sát các điều kiện lên men và lên men tạo sản phẩm

Dựa theo quy trình tạo sản phẩm thức uống lên men lactic từ malt, gạo lức, boza, yến mạch, cà chua … Quy trình lên men lactic từ nước ép cam được thể hiện ở sơ đồ 3.2

Loại bả ép

Sơ đồ 3.2 Quy trình sản xuất nước cam probiotic.

Cam

Ép

Dịch ép

Loại hạt

Phối trộn, chỉnh pH Đường , nước

Vi khuẩn L.acidophilus Thanh trùng 95oC/

30 phút

Làm nguội

Cấy giống

Lên men Đánh giá chất lượng SP

Theo dõi bảo quản phẩm

Sản phẩm

Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố

 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào nước ép

 Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung

 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ban đầu

 Ảnh hưởng của thời gian lên men

 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên men

Khảo sát các điều kiện lên men bao gồm theo dõi quá trình lên men dựa trên các chỉ tiêu

 Hàm lượng acid lactic sinh ra (%)

 Khả năng sử dụng đường trong môi trường

 Mật độ tế bào vi khuẩn

 Thông số pH

Chúng tôi tiến hành xác định chế độ và thành phần môi trường tối ưu theo phương thức chọn lọc thực nghiệm Các ảnh hưởng được khảo sát bằng cách cho 1 yếu tố thay đổi trong khoảng giới hạn còn các yếu tố khác giữ nguyên. Mặc dù tốn nhiều thời gian nhưng phương pháp này đáng tin cậy [3].

Các thí nghiệm được bố trí như sau

 Thí nghiệm 1- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước bổ sung vào dịch ép Mục đích : tìm ra một tỷ lệ pha loãng nhất định giữa dịch ép cam và nước thích hợp cho vi sinh vật lên men đồng thời giúp sản phẩm tạo thành có vị ngọt, vị chua vừa và màu sắc đẹp tự nhiên

Bảng 3.1 Bố trí thí thí nghiệm 1

Yếu tố cố định 17g đường/100ml

5% giống L. acidophilus Lên men 24 giờ ở 37oC pH 5

Yếu tố thay đổi

Tỷ lệ dịch ép quả: nước 1: 0

1: 1 2: 1 Các chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng acid lactic sinh ra Thông số pH

Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ tế bào Lactobacillus acidophilus

Cảm quan sơ bộ sản phẩm

 Thí nghiệm 2 – Khảo sát hàm lượng đường bổ sung

Đường là một cơ chất quan trọng trong quá trình lên men của vi khuẩn, lượng đường quá ít sẽ làm giảm khả năng lên men của vi sinh vật, cũng như ảnh hưởng đến mật độ tế bào vi sinh vật cho sản phẩm, mặt khác đường nhiều sẽ gây mất cân bằng áp suất thẩm thấu qua màng tế bào vi sinh vật, làm ức chế quá trình lên men đồng thời tốn nhiều nguyên liệu đường làm giá thành sản phẩm tăng lên. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra một tỷ lệ bổ sung đường hợp lý cho quá trình lên men cũng như tạo vị ngọt vừa cho sản phẩm.

Bố trí thí nghiệm như sau:

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2

Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1

Tỷ lệ cấy giống 5%

Lên men 24 giờ ở 37oC pH 5

Yếu tố thay đổi Hàm lượng đường 17g/100ml

19g/100ml 21g/100ml

Chỉ tiêu theo dõi Tương quan giữa lượng acid lactic sinh ra với hàm lượng đường bổ sung

Thông số pH

Hàm lượng chất khô ( brix) Mật độ L.acidophilus Cảm quan sơ bộ

 Thí nghiệm 3 – Khảo sát tỷ lệ cấy giống ban đầu

Tỷ lệ cấy giống ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, khả năng sinh acid lactic và mật độ vi khuẩn có trong sản phẩm, lượng giống ít sẽ kéo dài thời gian lên men và khả năng bị nhiễm cao, mặt khác tỷ lệ giống lớn sẽ làm rút ngắn thời gian lên men, hàm lượng acid lactic sinh ra lớn, tuy nhiên việc bảo quản sản phẩm ở các tuần tiếp theo sẽ rất khó khăn. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra một tỷ lệ cấy giống vừa phải nhưng hiệu quả cho quá trình lên men.

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 3

Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả : nước thích hợp đã xác định từ thí nghiệm 1

Hàm lượng đường thích hợp ở thí nghiệm 2

Lên men 24 giờ ở 37oC Yếu tố thay đổi Tỷ lệ cấy giống

3%

5%

7%

Chỉ tiêu theo dõi Tương quan giữa hàm lượng acid lactic sinh ra với tỷ lệ giống

Thông số pH

Hàm lượng chất khô (brix)

Mật độ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Cảm quan sơ bộ

 Thí nghiệm 4 -Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men

Mục đích : chọn thời gian lên men cho sản phẩm có lượng acid lactic sinh ra vừa đủ làm cho sản phẩm có vị chua ngọt vừa.

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 4

Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước

thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2 Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3 pH thích hợp ở thí nghiệm 4

Yếu tố thay đổi Thời gian lên men 12 giờ

24 giờ 36 giờ 48 giờ

Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng acid lactic sinh ra

Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ L.acidophilus Cảm quan sơ bộ

 Thí nghiệm 5 – Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men

Mục đích của thí nghiệm này nhằm chọn ra giá trị pH thích hợp cho quá trình lên men.

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 5

Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2 Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3 Thời gian lên men 24 giờ Nhiệt độ lên men 37oC

Yếu tố thay đổi Giá trị pH Đối chứng 4.5

5 5.5

Chỉ tiêu theo dõi Biến động pH

Hàm lượng lactic sinh ra Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ L.acidophilus Cảm quan sơ bộ

 Thí nghiệm 6 – Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men Mục đích của thí nghiệm này nhằm chọn ra nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men.

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 6

Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2

Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3

pH lên men thích hợp ở thí nghiệm 4

Thời gian lên men thích hợp ở thí nghiệm 5 Yếu tố thay đổi Nhiệt độ lên men

Nhiệt độ phòng 37

42

Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng acid lactic sinh ra

Hàm lượng chất khô ( brix)

Cảm quan sơ bộ

3.3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm

Đánh giá chất lượng sản phẩm qua các chỉ tiêu pH, độ brix, mật độ tế bào vi khuẩn lactic, cấu trúc sản phẩm và được so sánh tại các thời điểm bắt đầu bảo quản (thời điểm 0) và các tuần tiếp đó.

Các chỉ tiêu theo dõi định ra trong từng thí nghiệm sẽ luôn được xác định trong suốt thời gian lên men. Sau đó tiến hành lên men với các điều kiện tối ưu đã khảo sát và xác định hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4-6oC, các thông số xác đinh hoạt tính này bao gồm các chỉ tiêu pH, mật độ tế bào.

Đánh giá cảm quan cho phép giải quyết những bận tâm của nhà sản xuất trong quá trình kiểm tra nguyên liệu, quá trình sản xuất, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ và kỹ thuật đến sản phẩm cuối cùng, xác định thời hạn của sản phẩm và cuối cùng là phát triển sản phẩm mới [ 2].

Chất lượng thực phẩm được cấu thành bởi những tính chất đặc trưng và thị hiếu của người tiêu dùng. Các phương pháp phân tích chất lượng cho phép tiếp cận hai khía cạnh của chất lượng thực phẩm thông qua việc phân tích các thuộc tính và đánh giá thị hiếu người sử dụng. Thực tế nghiên cứu thị hiếu người tiêu dùng cho thấy mức độ ưa thích chung của người tiêu dùng chỉ tỉ lệ thuận với một số tính chất của sản phẩm.

Chúng tôi đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm qua phương pháp phép thử cho điểm chất lượng.

Thang tính điểm dựa theo TCVN 3215-79, thống nhất 4 bậc 5 điểm. Điểm 0 ứng với sản phẩm bị hỏng, từ điểm 1 đến 5 ứng với mức khuyết tật giảm dầm, mức điểm 5 là cao nhất cũng đồng nghĩa với việc sản phẩm có chất lượng tốt không mắc lỗi và khuyết tật nào.

Phép thử cho điểm thị hiếu đánh giá theo thang điểm 5, điểm 1 ứng với trạng thái rất “ghét”, từ điểm 2 đến điểm 5 ứng với mức độ ưa thích dần, điểm 5 ứng với trạng thái “rất thích”.

Chỉ tiêu vi sinh là chỉ tiêu vô cùng quan trọng của sản phẩm trước khi đưa ra thị trường nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng, ngoài ra chỉ tiêu vi sinh cũng rất quan trọng trong việc bảo quản sản phẩm, đối với các sản phẩm probiotic còn phải

đạt chỉ tiêu về vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản.