CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được
Quy trình:
- Mẫu SLs thô sẽ được hòa tan trong dung dịch DMSO 10 % , votex kỹ, để đạt nồng độ 20 mg/ml.
- Hút lần lượt 5 ml xăng, dầu đậu nành và dầu hạt cải cho vào các ống nghiệm.
0 20 40 60 80 100 120
0 10 20 30 40 50 60 70
% methanol
thời gian (t)
28
- Sau đó, thêm 5 ml dung dịch SLs thô vào từng ống nghiệm, votex kỹ trong 2 phút và để yên trong 24 giờ. Đối chứng âm được sử dụng là nước.
- Cuối cùng tiến hành quan sát, đo và tính toán kết quả.
Cách tính:
Chỉ số nhũ hóa sau 24 giờ được tính theo công thức:
E24 =
x 100 2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa
Nguyên tắc: DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; C18H12N5O6, M= 394,33) là một gốc tự do, trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm.
Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH
Nguồn: Patel Rajesh M và Patel Natvar J (2011).
Khi phản ứng với các chất có tính kháng oxy hóa, electron thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính kháng oxy hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng (Diphenylpicrylhydrazine) không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần chuyển sang màu vàng (Hình 2.4).
29 Quy trình:
- Hòa tan DPPH (dạng bột) vào ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ 0,12 mg/ml (10X). Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,012 mg/ml (1X) và bao tube lại bằng giấy bạc.
- Hòa tan vitamin C (dạng bột) – đối chứng dương, vào nước cất sau đó votex để đạt nồng độ 2 mg/ml (10X). Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,2 mg/ml (1X) và bao tube lại bằng giấy bạc.
- Mẫu SLs thô được hòa tan trong ethanol tuyệt đối, votex để đạt nồng độ 20 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ tương ứng: 20; 10; 5; 2,5;
1,25; 0,625; 0,3125; 0,156; 0,078 mg/ml.
- Hỳt 100 àl ethanol tuyệt đối – đối chứng õm cho vào giếng 1, 2 của hàng A.
- Hỳt 100 àl Vitamin C – đối chứng dương ở nồng độ 2 mg/ml cho vào giếng 1, 2 của hàng B và nồng độ 0,2 mg/ml vào giếng 1, 2 của hàng C.
- Hỳt lần lượt 100 àl mẫu SLs ở cỏc nồng độ tương ứng 20; 10; 5; 2,5; 1,25;
0,625; 0,3125; 0,156; 0,078 mg/ml cho vào các giếng 1, 2 của các hàng D, E, F, G, H, tương tự cho giếng 3, 4 của các hàng ở các nồng độ tiếp theo.
- Thờm 100 àl dung dịch DPPH vào tất cả cỏc giếng, trộn đều hỗn hợp.
- Bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 370C trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 517 nm.
Khả năng kháng oxi hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của mẫu SLs thô sẽ được tính theo công thức sau:
Khả năng kháng oxi hóa của mẫu = (1
) x 100 2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn
► Định tính khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Nguyên tắc: Dung dịch SLs sẽ khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên vi khuẩn được kiểm tra. Nếu SLs kháng được vi khuẩn kiểm tra thì sẽ xuất hiện
30
vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Độ lớn của vòng kháng khuẩn sẽ tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn so với dung dịch SLs.
Mục đích: Định tính sơ bộ khả năng kháng khuẩn của SLs thu được.
Quy trình:
- Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis và P.eruginosa.
Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng, ở 370C trong 24 giờ.
- Mẫu SLs thô được hòa tan trong DMSO 10 %, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml.
- Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch LB đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Tiến hành đục giếng thạch: đục bốn giếng gồm một giếng chứa đối chứng âm và ba giếng chứa dung dịch SLs thu được.
- Hỳt 100 àl dịch nuụi cấy của từng loại vi khuẩn lần lượt cho vào cỏc đĩa thạch, rồi dùng que cấy trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch.
- Hỳt 60 àl nước cất vụ trựng cho vào giếng đối chứng õm và hỳt 60 àl dung dịch SLs thu được lần lượt cho vào các giếng còn lại.
- Ủ đĩa ở 370C trong 24 giờ.
- Quan sát và đo vòng kháng khuẩn.
► Sử dụng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp có nồng độ của tác nhân kháng khuẩn khác nhau. Nồng độ thấp nhất của tác nhân kháng khuẩn sẽ được xác định khi tại đó có sự tác dụng ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn.
Mục đích: Phương pháp MIC được thực hiện trên đĩa 96 giếng nhằm xác định nồng độ SLs thô thấp nhất có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
31 Quy trình:
- Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis và P.aeruginosa. Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng, ở 370C trong 24 giờ.
- Mẫu SLs thô được hòa tan trong DMSO 10 %, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml. Sau đó, pha loãng dung dịch mẫu thành một dãy với các nồng độ: 5; 2,5; 1,25; 0,625 mg/ml.
- Hút 100 l dung dịch SLs thu được ở các nồng độ pha loãng lần lượt cho vào các giếng đã được đánh dấu.
- Thêm lần lượt 100 l dịch vi khuẩn của các chủng vi khuẩn trên vào các giếng tương ứng.
- Đối chứng:
+ Đối chứng âm: 100 l dịch vi khuẩn và 100 l môi trường LB lỏng.
+ Đối chứng dương 100 l dịch vi khuẩn và 100 l kháng sinh Ampicillin nồng độ 1 mg/ml.
- Trộn đều hỗn hợp dung dịch ở tất cả các giếng. Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 600 nm và ghi nhận lại.
- Đem Ủ ở 370C, trong 24 giờ và đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 600 nm, ghi nhận lại để so sánh sự thay đổi OD trước và sau khi ủ nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs thu được với các chủng vi khuẩn.