33
Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác nhau Theo hình 3.2, có thể thấy rằng sản lượng SLs tăng dần từ ngày lên men thứ 3 đến ngày thứ 7 và đạt cao nhất vào ngày lên men thứ bảy (21,9 g/l). Tuy nhiên, sau đó sản lượng lại giảm xuống (17,8 g/l) ở ngày thứ 10. Điều này cho thấy tế bào nấm men C.bombicola bắt đầu sản xuất SLs vào giai đoạn cuối pha lũy thừa và khi tế bào bước vào pha cân bằng. Kết quả này cũng cho thấy sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của Davila và cộng sự (1992). Bởi vì là hợp chất ngoại bào nên sau khi được tổng hợp SLs sẽ được tiết ra và tích lũy dần trong môi trường lên men, làm cho sản lượng SLs tăng liên tục và đạt cao nhất vào pha cân bằng. Khi bước vào pha suy vong sản lượng SLs giảm xuống có thể do các phân tử SLs bị phân hủy bởi enzyme hoặc do một tác nhân khác.
Như vậy, thời gian lên men thích hợp nhất cho quá trình thu nhận SLs thô là sau 7 ngày kể từ ngày cấy chủng và sản lượng SLs đạt 21,9 g/l.
3.3. Kết quả định tính SLs thu đƣợc bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sau khi phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC Silicagel 60 F254) mẫu SLs thô thu nhận được từ quá trình lên men C.bombocola ATCC 22214, sử dụng glucose và dầu
1.53
1.98
2.19
1.78
0 0.5 1 1.5 2 2.5
3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày
Sản lƣợng SLs (g/100ml)
thời gian lên men (ngày)
34
thải nhà hàng như nguồn carbon chính trong môi trường lên men. Bản sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được
(1) Chất chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate, (2) Mẫu SLs thu được
Theo như hình 3.3 có thể nhận thấy trong mẫu SLs thô có sự hiện diện của 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate. Bên cạnh đó, còn có một số vạch khác trên bảng sắc ký đồ, cho thấy sự có mặt của một số hợp chất khác trong mẫu SLs thô đã thu được. Theo Van Bogaert và cộng sự (2011), SLs được tổng hợp như là hỗn hợp của hai phân tử hơi khác nhau về cấu trúc, mà hai điểm chính trong sự khác biệt đó là sự lactone hóa tạo SLs lacton và acetyl hóa tạo mô hình acetyl. Kim và cộng sự (2005) cho rằng SLs tạo ra qua quá trình lên men C.bombicola gồm hai dạng SLs lacton và SLs acid, nhưng tỷ lệ của hai loại là khác nhau khi sử dụng các loại dầu khác nhau như: dầu ngô, dầu nành và SDO như nguồn carbon. Từ những dẫn chứng trên, có thể lý giải cho những vạch sắc ký đồ khác 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate là một dạng SLs khác hoặc mẫu SLs thu được chưa tinh khiết, có thể chứa một số chất khác như glucose, các acid béo...
35
Như vậy, SLs thu được từ quá trình lên men glucose và dầu thải bởi nấm men Candida bombicola ATCC 22214 là một hỗn hợp của nhiều dạng SLs với cấu trúc khác nhau, trong đó bước đầu xác định được có sự hiện diện của dạng 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate.
3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu đƣợc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sophorolipids là hỗn hợp nhiều chất. Chúng gần như giống nhau về mặt cấu trúc, nhưng do mức độ ester hóa hoặc acetyl hóa khác nhau đã tạo ra nhiều dạng SLs khác nhau. Vì vậy, thí nghiệm phân tích thành phần SLs trong mẫu thu được đã tiến hành.
Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được qua quá trình lên men glucose và dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214, được thể hiện ở sắc ký đồ hình 3.4. Bên cạnh đó, để kiểm tra tính chính xác của thí nghiệm, mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″- diacetate (Sigma) cũng được gửi đi phân tích tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. HCM (Địa chỉ: 02 Nguyễn Văn Thủ, Phường Đa Kao, Quận 1, Tp. HCM – phụ lục C) và cho kết quả tương tự.
Theo như bảng sắc ký đồ ở hình 3.4 và hình 3.5 xuất hiện hai đỉnh peak (9-10) tương thích với mẫu chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate, thời gian lưu từ phút 33 – 34. Ngoài ra, cũng phát hiện một số đỉnh peak khác so với mẫu SLs chuẩn 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate, điều này có thể khẳng định cho những lập luận trước đó ở mục 3.3 có cơ sở hơn và phù hợp với các nghiên cứu trước đó [12].
Có thể kết luận rằng, trong mẫu SLs thu được qua quá trình lên men glucose và dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214, có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Trong đó, cấu trúc 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate cũng được xác định và thời gian lưu khi ra khỏi cột sắc ký từ phút 33 – 34.
36
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate.
37
3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu đƣợc
Khả năng nhũ hóa được xem như một trong những hoạt tính cơ bản của chất hoạt động bề mặt. Vì vậy, mẫu SLs thô cũng được tiến hành khảo sát hoạt tính nhũ hóa trên một số cơ chất kỵ nước như: xăng, dầu nành, dầu hạt cải, cũng đã thu được một số kết quả khả quan (Bảng 3.1).
Kết quả cho thấy ở 300C trong 24 giờ, hỗn hợp SLs thu được tạo được lớp nhũ tương và có khả năng nhũ hóa một số cơ chất được khảo sát. Trong đó, hỗn hợp SLs thu được có khả năng nhũ hóa mạnh hơn đối với dầu hạt cải, dầu đậu nành, yếu hơn với xăng. Điều này cũng cho thấy rằng khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được là phụ thuộc vào sự tương tác trực tiếp giữa phần kỵ nước của SLs với cơ chất kỵ nước được khảo sát.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được.
Cơ chất kỵ nước Chỉ số nhũ hóa (E24) (%)
Xăng 39,39 % 1,05
Dầu hạt cải 63,64 % 1,82
Dầu đậu nành 65,45 % 1,80
Như vậy, hỗn hợp SLs thu được có khả năng nhũ hóa một số cơ chất kỵ nước như xăng, dầu hạt cải và dầu đậu nành với chỉ số nhũ hóa (E24) từ 39,39 – 65,45 %.
3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu đƣợc
Để khảo sát khả năng bắt góc tự do của SLs, thử nghiệm DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) đã được thực hiện. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của SLs được thể hiện qua hình 3.6.
Theo như biểu đồ cho thấy khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được tăng dần theo nồng độ của SLs từ 0,078 – 20 mg/ml. Ở nồng độ 20 mg/ml SLs có khả năng kháng oxy hóa 84,32 %. Nồng độ SLs thu được ức chế các gốc tự do DPPH ở 50 % (IC50) cũng được xác định là 4,4531 mg/ml.
38
Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được.
Khả năng bắt các góc tự do của SLs cho thấy SLs có tiềm năng ứng dụng trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm là khá cao.
3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu đƣợc
3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được thực hiện. Các chủng vi khuẩn S.aureus, B.subtilis và P.aeruginosa được dùng làm chủng chỉ thị. Kết quả thu nhận được trình bày ở hình 3.7 và bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch
STT Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 1 Staphylococcus aureus 18,3 0,6
2 Bacillus subtilis 14,7 0,6
3 Pseudomonas aeruginosa 7,2 0,8
39
Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch(-) đối chứng âm; (1), (2), (3) mẫu SLs
Từ bảng kết quả cho thấy SLs thu được có khả năng kháng S.aureus mạnh nhất, đường kính vòng kháng khuẩn lên đến 18 mm, kháng P.aeruginosa là yếu nhất, đường kính vòng kháng khuẩn chỉ 7 mm. Bước đầu có thể thấy rằng hỗn hợp SLs thu được có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn thuộc Gram (+) mạnh hơn so với các chủng vi khuẩn thuộc Gram (-).
3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch LB chỉ là một phương pháp để định tính, kiểm tra sơ bộ chứ không cho phép định lượng chính xác khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp SLs thu được. Do đó, hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp SLs thu nhận sẽ được đo lường dựa trên phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thao tác trên đĩa 96 giếng với các chủng vi khuẩn S.aureus, B.Subtilis và P.aeruginosa.
Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hỗn hợp SLs thu nhận được đối với các chủng vi khuẩn được trình bày ở bảng 3.3.
Kết quả cho thấy hỗn hợp SLs thu được có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn.
Trong đó, hoạt tính ức chế có hiệu quả nhất là đối với B.subtilis (0,6 mg/ml) yếu hơn với S.aureus (1,25 mg/ml) và P.aeruginosa (2,5 mg/ml).
40
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
STT Chủng vi khuẩn Nồng độ ức chế
tối thiểu (mg/ml)
1 Staphylococcus aureus 1,25
2 Bacillus subtilis 0,60
3 Pseudomonas aeruginosa 2,5
Hoạt tính kháng khuẩn của SLs thu được đối với các chủng vi khuẩn trên ở nồng độ SLs khá thấp, cho thấy tiềm năng ứng dụng SLs cao như là chất sát trùng, kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu quả điều trị, thích hợp để làm sạch trái cây và rau quả, da và tóc khi kết hợp SLs với các acid trái cây như acid citric, acid lactic và acid [46].