CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý nguyên liệu sơ bộ đến khả năng trích ly màu anthocyanin
Mục đích thí nghiệm:
. Chuẩn bị thí nghiệm:
- Mẫu gạo đen đã nghiền sẵ 3.
- Chuẩn bị : HCl 1% (85:15, v/v).
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát 3 nhiệt độ xử lý nguyên liệu:
B1: kích thước hạt 0.0098 inches không xử lý nhiệt B2: kích thước hạt 0.0098 inches nấu ở 800C/5 phút B3: kích thước hạt 0.0098 inches nấu ở 900C/ 5 phút
Thí nghiệm bao gồm 3 nghiệm thức (Bảng 2.2), mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 2.2Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của xử lý nhiệt độ nguyên liệu đến khả năng trích ly
Nghiệm thức Yếu tố khảo sát
Nghiệm thức 1 Kích thước hạt 0.0098 inches không xử lý nhiệt Nghiệm thức 2 Kích thước hạt 0.0098 inches nấu ở 800C/5 phút Nghiệm thức 3 Kích thước hạt 0.0098 inches nấu ở 900C/ 5 phút
44
Hình 2.5 ảo sát xử lí nhiệt độ nguyên liệu đến khả Định lƣợng
Anthocyanin
60oC 60 p TL 1:20 (w:v )
G đen
ggggg
Dung môi
Ly tâm
4000 rp m
Ngh ggggg
80oC/5p ggggg
90oC/5p ggggg Nhiệt độ
phòng/5p ggggg
0,0098 inches
ggggg
EtOH:HCl 1%
85:15 v:v
ggggg
Chọn chế độ xử lý nhiệt Định mức
45
Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lƣợng anthocyanin.
2.3.5. Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) làm dung môi trích ly anthocyanin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng trích ly anthocyanin từ gạo đen của các tỷ lệ dung môi Ethanol và HCl(1%), từ đó tìm ra tỷ lệ dung môi có khả năng trích ly tối ƣu nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Thí nghiệm 4 đƣợc tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 3 4 .
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
- (80:20; 85:15; 90:10; 95:05;
98:02; 99:01)
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát 6 tỷ lệ dung môi (C):
C1: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 80:20 C2: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 85:15 C3: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 90:10 C4: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 95:05 C5: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 98:02 C6: Tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) 99:01
Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (Bảng 2.3) Bảng 2.3Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl (1%) đến khả năng trích ly
Nghiệm thức Tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl(1%)
Nghiệm thức 1 80:20
Nghiệm thức 2 85:15
Nghiệm thức 3 90:10
Nghiệm thức 4 95:05
Nghiệm thức 5 98:02
46
Nghiệm thức 6 99:01
Hình 2.6 ối ƣu hóa tỷ lệ Ethanol:HCl (1%) làm dung môiđến khả
Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lƣợng anthocyanin.
Định lƣợng Anthocyanin
Chọn tỷ lệ HCl tối ƣu Định mức
n
0,0098 inches
60oC 60 p TL 1:20 (w:v ) 4000 rp m
ggggg
Dung môi
Ly tâm G đen
ggggg
TL 98:2 ggggg TL 95:5
ggggg
TL 99:1 ggggg TL 85:15
ggggg TL 80:20
ggggg
TL 90:10 ggggg
47
2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng trích ly anthocyanin từ gạo đen ở các nhiệt độ khác nhau. Từ đó, tìm ra nhiệt độ tối ƣu cho việc trích ly.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Thí nghiệm 5 đƣợc tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 3, 4 5
. - Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v)
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát 5 khoảng nhiệt độ (T) T1: Nhiệt độ trích ly 500C T2: Nhiệt độ trích ly 550C T3:Nhiệt độ trích ly 600C T4: Nhiệt độ trích ly 650C T5: Nhiệt độ trích ly 700C
Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần (Bảng 2.4)
Bảng 2.4Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly
Nghiệm thức Nhiệt độ trích ly Nghiệm thức 1 500C
Nghiệm thức 2 550C Nghiệm thức 3 600C Nghiệm thức 4 650C Nghiệm thức 5 700C
48
Hình 2.7 ảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả đen
Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lƣợng anthocyanin.
Định mức
Định lƣợng Anthocyanin
Chọn nhiệt độ trích ly
60 p TL 1:20 (w:v )
ggggg
Dung môi
Ly tâm G đen
EtOH:HCl 1%
95:5, v :V
70oC ggggg
65oC ggggg
55oC ggggg
50 oC ggggg
60oC ggggg
0,0098 inches
4000rp m
49
2.3.7. Thí nghiệm 7: khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng trích ly anthocyanin từ gạo đen ở các khoảng thời gian trích ly khác nhau. Từ đó, tìm ra thời gian trích ly tối ƣu nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Thí nghiệm 6 đƣợc tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 3, 4, 5 6
.
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát các khoảng thời gian trích ly E1: Thời gian trích ly 50 phút
E2: Thời gian trích ly 55 phút E3:Thời gian trích ly 60 phút E4: Thời gian trích ly 65 phút E5: Thời gian trích ly 70 phút
Bảng 2.5Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Nghiệm thức Thời gian trích ly
Nghiệm thức 1 50 phút
Nghiệm thức 2 55 phút
Nghiệm thức 3 60 phút
Nghiệm thức 4 65 phút
Nghiệm thức 5 70 phút
50
Hình 2.8 ảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả ch ly
Chỉ tiêu theo dõi: tính toán hàm lƣợng anthocyanin.
2.3.8.
: Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH và lập đường chuẩn xác định giá trị IC50 của anthocyanin và Ascorbic acid.
:
Chọn thời gian trích ly
Định mức
Định lƣợng Anthocyanin
55oC TL 1:20 (w:v )
ggggg
Dung môi
Ly tâm G đen
EtOH:HCl 1%
95:5, v :V
70 phút ggggg 65 phút
ggggg 55 phút
ggggg 50 phút
ggggg
60 phút ggggg
0,0098 inches
4000rp m
51
Dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.
Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:2 (w/v).
:
.D.Sanjaet al. (2009).
100 àl, 120 àl, 140 àl, 160 àl, 180 àl, 200 àl dị
(mẫ , nhiệt độ
.
516nm (B .
15 phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở
.
:
-Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 l ần.
-Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất đối chứng là Ascorbic acid (100àg/ml).
Ch :
Đo độ hấp thu màu của lƣợng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.
Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.
2.3.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cô - quay đến hoạt tính oxy hóa của anthocyanin
: Xác định thời gian cô quay. Cô quay đến thể tích bao nhiêu là tối ƣu nhất. Đồng thời xác định hàm lƣợng anthocyanin sau khi cô quay.
:
-700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.
52
-Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v).
:
-Cân khối lƣợng bình cô quay khô, m.
-Cân lại khối lƣợng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0.
-Tiến hành cô quay lần lƣợt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml.
-Nhiệt độ cô quay là 40-45oC.
-Cân lại khối lƣợng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút, bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta đƣợc khối lƣợng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18. Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lƣợng anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa.
:
Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu c ủa lƣợng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.
Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.
Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và sau cô quay.
2.4.
- Định lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai.
- Thử hoạt tính kháng oxy hóa và xác định giá trị IC50 của anthocyanin bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH.
- Phương pháp xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu.
2.5. Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu - Vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2013.
- Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp lại. Dữ liệu đƣợc phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic Plus 4.0.
Sự khác biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thố ng kê khi giá trị p < 0,05.