Bảng 3.3Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý nguyên liệu sơ bộ đến khả năng trích ly
Trạng thái nguyên liệu Hàm lƣợng Anthocyanin (mg/ml)
Kích thước hạt 0.0098 inches – không xử lí nhiệt 7.323±0,202 Kích thước hạt 0.0098 inches – 800C/5 phút 3,563±0,306 Kích thước hạt 0.0098 inches – 900C/5 phút 3,382±0,512
Hình 3.3Đồ thị biển diễn hàm lƣợng anthocyanin trích ly đƣợc khi xử lý nhiệt sơ bộ
Với thí nghiệm này ta thấy nguyên liệu không xử lí nhiệt sẽ cho hàm lƣợng anthocyanin nhiều nhất là 7.324 ± 0.202 (mg/ml). Kế đến là xử lí nhiệt 800C/5 phút với hàm lƣợng anthocyanin là 3.563 ± 0.512 (mg/ml) và cuối cùng là xử lí nhiệt 900C với hàm lƣợng là 3.382 ± 0.306 (mg/ml).
Theo nhiều nghiên cứu trên thới giới việc trích ly anthocyanin từ các nguồn nguyên liệu khác nhau đa số không qua xử lý nhiệt. Nhƣng cũng có một số loại
7.496
3.563 3.382
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t
0.0098 inches 80oC/5p 90oC/5p
Hàm LƣợngAnthocianin (mg/ml)
Tình trạng mẫu
57
nguyên liệu cần đƣợc xử lý nhiệt thì hàm lƣợng anthocyanin cho ra nhiều hơn nhƣ ở khoai lang tím (Hoàng Thị Lệ Hằng, 2014). Vì vậy, chúng ta cần tiến hành khảo sát việc xử lý nhiệt độ sơ bộ với gạo đen thì sẽ cho hiệu quả nhƣ thế nào?
Tuy nhiên, từ kết quả thí nghiệm ở gạo đen cho thấy, việc xử lý nhiệt tương tự không những tốn thời gian và công sức mà còn làm giảm đáng kể hàm lƣợng anthocyanin so với việc không cần xử lý nhiệt sơ bộ dối với nguyên liệu. Nguyên nhân có thể đƣợc dự đoán là do, khi xử lý nhiệt độ thì mức độ hồ hóa tinh bột trong gạo đen sẽ xảy ra dẫn đến hiện tƣợng tạo keo, cản trở sự khuếch tán của anthocyanin từ nguyên liệu ra bên ngoài. Một nguyên nhân nữa có thể khi xử lý nhiệt độ càng cao thì sự phân hủy anthocyanin càng nhiều (Laleh et al., 2006).
Với kết quả trên ta thấy không có sự sai khác quá lớn hàm lƣợng anthocyanin trích ly đƣợc từ nguyên liệu đƣợc xử lí nhiệt 800C và 900C trong 5 phút.Nhƣng có sự sai khác rất lớn với nguyên liệu không xử lí nhiệt.
Ta thấy nguyên liệu không cần xử lý nhiệ ệu quả trích ly anthocyanin cao nhất.
3.5. Khảo sát tối ƣu hóa tỷ lệ Ethanol và HCl(1%) làm dung môi trích ly Bảng 3.4Kết quả tối ƣu hóa tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl(1%)
Tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl(1%) Hàm lƣợng Anthocyanin (mg/ml)
80:20 3,215±0,195
85:15 6,661±0,908
90:10 7,967±0,417
95:05 13,266±1,56
98:02 2,635±1,218
99:01 2,190±0,429
58
Hình 3.4Đồ thị hàm lƣợng anthocyanin trích ly với tỷ lên dung môi Ethnol:HCl (1%) khác nhau
Từ đồ thị biểu diễn kết quả ta thấy,cùng với lƣợng nguyên liệu ban đ ầu hàm lƣợng anthocyanin trích ly tăng dần theo việc tăng tỷ lệ thể tích Ethanol và giảm tỷ lệ thể tích HCl (1%) trong dung môi trích ly. Tuy nhiên khi t ỷ lệ Ethanol tăng càng cao và tỷ lệ HCl (1%) càng thấp thì hàm lƣợng anthocyanin trích ly l ại giảm. Cụ thể hàm lƣợng anthocyanin trích ly tăng từ giá trị Ethanol:HCl (1%) là 80:20 (3,215 ± 0,195 (mg/ml)) < 85:15 (6,661 ± 0.908 (mg/ml)) < 90:10 (7,967 ± 0,417 (mg/ml)) và đạt cao nhất ở 95:05 (13,266 ± 1,56 (mg/ml)). Sau đó lại giảm ở tỷ lệ
Ethanol:HCl (1%) 98:02 (2,635 ± 1,218 (mg/ml)) > 99:01 (2,190 ± 0,429 (mg/ml)).
Có thể dự đoán là dokhi sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau nên ái lực giữa anthocyanin và từng hệ dung môi cũng khác nhau. Điều đó dẫn đến việc nồng độ anthocyanin trong dịch trích ly sẽ khác nhau đối với từng tỷ lệ dung môi.
Anthocyanin là hợp chất phân cực, nên tan tốt trong nước đặc biệt là tan tốt trong MeOH, nhƣng vì mục tiêu của đồ án để ứng dụng trong thực phẩm nên không thể sử dụng MeOH do tính độc hại của nó. Thay vào đó ta sẽ sử dung hệ dung môi EtOH - nước – HCl để làm dung môi trích ly. Vì EtOH không gây độc hại như MeOH mà hiệu suất trích ly vẫn tương đương (Nguyễn Thị Thanh Tuyền, 2014) và một nguyên nhân quan trọng nữa là EtOH dễ sản xuất, giá thành thấp. Đồng thời dễ
3.215
6.661
7.967
13.266
2.635 2.19
0 2 4 6 8 10 12 14 16
80 - 20 85 - 15 90 - 10 95 - 5 98 - 2 99 - 1
Hàm LƣợngAnthocianin (mg/ml)
Tỷ lệ dung môi (EtOH:HCl)
59
bay hơi nên việc đuổi ra khỏi dịch trích sẽ dễ dàng hơn, không cần những công đoạn phức tạp khác. Từ đó, dẫn đến hiệu quá kinh tế cao hơn.
Hệ
.
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly
Bảng 3.5Kết quả khảo sát ảnh hưởng c ủa nhiệt độ đến khả năng trích ly Nhiệt độ trích ly (0C) Hàm lƣợng Anthocyanin (mg/l)
50 5.543±0.676
55 8.405±0.391
60 7.310±0.866
65 4.237±0.585
70 4.279±0.741
Hình 3.5Đồ thị hàm lƣợng anthocyanin với các nhiệt độ trính ly khác nhau 5.543
8.405
7.31033
4.237 4.279
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
50 55 60 65 70
Hàm Lƣợng Anthocianin (mg/l)
Nhiệt độ (độ C)
60
Kết quả cho thấy theo chiều tăng của nhiệt độ, hàm lƣợng anthocyanin trong dịch trích tăng đến khi đạt giá trị cực đại sau đó bắt đầu giảm dần. Nhiệt độ 550C trích ly cho ra hàm lƣợng anthocyanin nhiều nhất là 8,405 ± 0,391 (mg/l) . Tiếp theo là nhiệt độ trích ly 600C > 500C > 700C > 650C với hàm lƣợng anthocyanin l ần lƣợt là 7.310 ± 0.866 (mg/l) > 5.543 ± 0.676 (mg/l)>4.279 ± 0.741 (mg/l) > 4.237 ± 0.585 (mg/l).
Nhiệt độ trích ly có ảnh hưởng đến khả năng chiết tách anthocyanin là một trong các yếu tố làm biến tính và mất màu chủ yếu ở anthocyanin. Khi nhiệt độ tăngsẽ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán của anthocyanin vào dung môi ảnh hưởng đến khả năng hoạt động, sự tương tác và ái l ực của dung môi đối với anthocyanin.
Tuy nhiên nhiệt độ càng cao, khả năng bị oxy hóa và mất màu của anthocyanin tăng dần. Vì vậy, nhiệt độ trích ly phù hợp sẽ cho hàm lƣợng anthocyanin cao.
- Nếu nhiệt độ trích ly quá thấp, quá trình diễn ra chậm, anthocyanin trong dịch trích ly sẽ có thời gian đủ lâu để bị oxy hóa làm giảm hoạt tính kháng oxy hóa cũng nhƣ nồng độ cũng sẽ giảm theo hàm thời gian.
- Nếu nhiệt độ quá cao, quá trình diễn ra nhanh chóng, nhƣng anthocyanin vô cũng nhạy cảm với nhiệt độ cao. Đồng thời trong trường hợp này nhiệt độ còn là tác nhân cộng hưởng với oxy trong không khí làm tăng oxy hóa anthocyanin một cách mạnh mẽ.
Nhiệt độ là nhân tố đóng vai trò quan trọng ổn định cấu trúc của phân tử anthocyanin. Việc tăng nhiệt độ làm gia tăng sự phân hủy anthocyanin. Theo Palamidis và Markakis (1975) nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định của anthocyanin, khi nhiệt độ trong kho trữ tăng sẽ làm tăng khả năng phân hủy của các anthocyanin trong thức uống nhẹ (G.H. Laleh và cộng sự, 2006).
Đồng thời trong gạo đen có tinh bột, nếu nhiệt độ trích ly cao có thể làm biến đổi cấu trúc hạt tinh bột đẫn đến việc hồ hóa tạo keo làm cho anthocyanin khuếch tán khó khăn dẫn đến giảm hàm lƣợng anthocyanin trích ly.
61 550
550 ,
.
Từ kết quả trên ta chọn nhiệt độ trích ly là 550C cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly
Bảng 3.6Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Thời gian trích ly (phút) Hàm lƣợng Anthocyanin (mg/l)
50 5.307±0.859
55 7.570±0.783
60 13.322±1.097
65 6.030±0.877
70 4.560±0.678
5.307
7.57
13.322
6.03
4.56
0 2 4 6 8 10 12 14 16
50 55 60 65 70
Hàm Lƣợng Anthocianin (mg/l)
Thời gian trích ly (giờ)
62
Hình 3.6Biểu đồ thể hiện hàm lƣợng anthocyanin trích ly với các thời gian khác nhau
Kết quả cho thấy hàm lƣợng anthocyanin tăng dần theo thời gian trích ly đến khi đạt giá trị cực đại, sau đó giảm xuống.Thời gian 60 phút trích ly cho hàm lƣợng anthocyanin cao nhất là 13.322 ± 1.097 (mg/l). Tiếp theo là thời gian 55 phút > 65 phút > 50 phút > 70 phút với hàm lƣợng anthocyanin l ần lƣợt là 7.570 ± 0.783 (mg/l) > 6.030 ± 0.877 (mg/l) >5.307 ± 0.859 (mg/l) > 4.560 ± 0.678 (mg/l).
Quá trình trích ly anthocyanin phụ thuộc vào thời gian trích ly. Nếu thời gian trích ly quá ngắn không đủ để dung môi thấm vào nguyên liệu và anthocyanin khuếch tán vào dung môi (ở thời gian 50 và 55 phút); ngƣợc lại thời gian trích ly lâu sẽ thu đƣợc lƣợng anthocyanin nhiều hơn (60 phút). Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian trích ly quá lâu có thể làm giảm hàm lƣợng anthocyanin trích đƣợc do anthocyanin bị phân hủy dưới tác dụng của các tác nhân khác (ở thời gian 65 và 70 phút).
Có thể hiểu trích ly anthocyanin từ gạo đen bằng dung môi Ethanol:HCl (1%) một phần là sự khuếch tán nhờ vào sự trên lệch gradient nồng độ. Ta có thể dự đoán rằng thời gian trích ly ngắn thì gradient nồng độ chƣa đạt đến điểm cân bằng nên lƣợng anthocyanin trong nguyên liệu chƣa khuếch tán hết ra ngoài (50 và 55 phút). Ở thời gian 60 phút thì gradient nồng độ cân bằng cho hàm lƣợng anthocyanin nhiều hơn. Và ở thời gian (65 và 70 phút) không còn sự chênh lệch gradient nồng độ nên hàm lƣợng anthocyanin không tăng thêm, nhƣng khi trích ly với thời gian lâu như vậy thì một phần anthocyanin sẽ oxy hóa và phân hủy dưới các tác nhân khác từ môi trường.
Từ kết quả trên ta chọn thời gian trích ly anthocyanin là 60 phút vừa đủ để trích ly được nhiều anthocyanin mà lại không bị ảnh hưởng bởi các tác nhân khác.
Nên chọn thời gian 60 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
63 3.8.
4.
Hình 3.7 Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với LogCo (Co là nồng độ anthocyanin mg/ml)
5.
6. Hình 3.8Mối tương quan giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log(Ascorbic acid, àg/ml).
Bảng 3.8.1So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin
Mẫu Giá trị IC50 với chất oxy hóa DPPH
Dịch trớch ly anthocyanin gạo đen 636 àg/ml
y = 64.182x + 62.614 R² = 0.9699
-20.000 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1
% Ức chế DPPH
Log[anthocyanin, mg/ml]
y = 104.07x - 81.602 R² = 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
% Ức chếDPPH
Log[Ascorbic acid,àg/ml]
64
Ascorbic acid 18,145 àg/ml
7.
8. Trong thí nghiệm này, giá trị IC50 của dịch trích ly anthocyanin t ừ gạo đen cao hơn chất chuẩn đối chứng gấp 35 lần. Cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin ở thí nghiệm này còn thấp.
9. Do chưa có chất chuẩn để lập đường chuẩn nồng độ anthocyanin vì thế hàm lượng anthocyanin được xác định dựa trên phương pháp pH vi sai chỉ mang tính tương đối.
10. Thực tế nếu định lượng anthocyanin bằng phương pháp lập đường chuẩn thì hàm lƣợng anthocyanin trong mẫu phân tích có thể cao hơn 46,200 ± 0,964
(mg/mL). (Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor, 2009).
11. Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly cô đặc là: 46,200 ± 0,964 (mg/mL).
12. Giá trị IC50 của anthocyanin khi sử dụng phương pháp bắt gốc tự do DPPH là IC50=636 (àg/mL). Và của chất chuẩn Ascorbic acid là IC50=18,145àg/ml.
3.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cô quay đến hoạt tính oxy hóa của anthocyanin
Hình 3.9.Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay.
Hàm lƣợng anthocyanin tăng theo thời gian cô quay.Cô quay càng lâu thì dịch chiết càng đặc.
4.62 5.742 7.062 8.136
10.265
19.086
26.795
4 7 10 13 16 19 22 25 28
0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút
Hàm lượng anthocyanin, mg/ml
Thời gian
65
Hình 3.10Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong quá trình cô quay dịch trích ly theo thời gian
Hình 3.11Sự thay đổi về khối lƣợng của dịch chiết bán thành phẩm theothời gian cô quay.
Khối lƣợng của dịch cô quay còn lại giảm liên tục theo thời gian cô quay, tuân theo quy luật của hàm đa thức bậc 2:
y = 0.4365x2 - 15.168x + 95.176 với R² = 0.9925
100 99
95 94
89 88
76
50 60 70 80 90 100 110
0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút
Hiệu suất thu hồi anthocyanin %
Thời gian cô quay, phút
81.871
65.091
50.989
43.685
32.853
17.429
10.715 y = 0.4365x2- 15.168x + 95.176
R² = 0.9925
0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000 80.000 90.000
0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút
Khối lượng dịch cô quay, g
Thời gian cô quay, phút
66
Từ đó, dựa vào thời gian cô quay, ta có thể xác định được tương đối chính xác khối lượng dịch còn lại sau cô quay là bao nhiêu gam. Với hệ số tương quan R² = 0.9925.
Hình 3.12Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô quay.
Từ 100 mL dịch, sau thời gian cô quay là 18 phút/40oC, giảm còn 13.088 mL (giảm 7,64 lần).
Hình 3.13.Ảnh hưởng của thời gian cô quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen.
100.000
79.504
62.279
53.358
40.127
21.288
13.088 0.000
20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000
0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút
Thểtích dịch cô quay mL
Thời gian, phút
49.568 49.402 49.535 49.07
48.008
45.817
39.177
35 37 39 41 43 45 47 49 51
0 phút 3 phút 6 phút 9 phút 12 phút 15 phút 18 phút
% Ức chếDPPH
Thời gian cô quay, phút
67
Bảng 3.9.1. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay.
Thời gian cô quay (phút) Qtb (%)±SD
0 phút 49.568±0.527a
3 phút 49.402±0.399a
6 phút 49.535±0.305a
9 phút 49.070±0.304a
12 phút 48.008±0.398b
15 phút 45.817±1.212c
18 phút 39.177±0.414d
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05.
Khả năng bắt gốc tự do DPPH giảm theo thời gian cô quay. Ở cùng nồng độ 4,62 mg/ml, khả năng bắt gốc tự do của dịch trích ly giảm 10% so với lúc trước khi cô quay.
Từ đồ thị hình 3.10,hiệu suất thu hồi anthocyanin giảm theo thời gian cô quay.
Nguyên nhân do anthocyanin là chất có ho ạt tính kháng oxy hóa, nên thời gian cô quay 18 phút ở 40-45oC làm một phần anthocyanin bị oxy hóa, vì thế hàm lƣợng giảm 14% so với ban đ ầu.
Từ đồ thị 3.13 và bảng 3.3 cho thấy:
-Sau 15 phút cô quay, khả năng kháng DPPH của anthocyanin trong dịch trích ly giảm 4,8% so với dịch trích ly ban đầu.
- Sau 18 phút cô quay, khả năng kháng DPPH c ủa anthocyanin trong dịch trích ly giảm 6,7% so vớidịch trích ly ban đ ầu.
Khi thời gian cô quay tăng lên thì dịch chiết bán thành phẩm cũng đồng thời đặc hơn, có nghĩa là hàm lƣợng anthocyanin trong mỗi 1 ml của dịch chiết đã đƣợc cô đặc sẽ tăng dần;điều này xảy ra là do sự giảm của thẻ tích trong thời gian cô quay.
(Hình 3.9 và 3.12). Trong thí nghiệm này thì khi dừng ở 18 phút, lúc đó dịch cô quay đã đặc đến 7,64 lần. Tương ứng với hiệu suất thu hồi giảm đến 76% và khả năng kháng oxy hóa đạt 39,18%.
Nguyên nhân làm hoạt tính kháng DPPH của dịch trích ly giảm:
Oxy và nhiệt độ đƣợc xem là những tác nhân đặc trƣng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự kết tủa và đóng váng có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase.
Oxy sẽ hóa mãnh liệt các anthocyanin khi nung nóng.Cơ chế của sự phân hủy nhiệt
68
xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân anthocyanin đó.
Để thu được dịch chiết có các tiêu chí sau:
- chứa ít dung môi.
- dịch chiết cố đặc có nồng độ athocyanin cao - hoạt tính kháng oxy hóa tốt.
Nhóm nghiên cứu đề xuất chọn thông số cho quá trình cô quay dịch trích ly có thể tích 100mL tương đương 81,817 g, nồng độ 4,620 (mg/ml):
- Thời gian cô quay là 15 phút.
- Cô quay đến thể tích cuối cùng là 21,288 ml (hoặc khối lượng 19,068g).
- Cô quay đến nồng độ là 19,086 (mg/ml).
- Hiệu suất thu hồi anthocyanin dựa trên hàm lương đạt 88%.
- Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết cô đặc đạt 45,817%. (giảm 8% so với dịch chiết ban đầu)