CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm. Các nội dung chủ yếu được thực hiện như sơ đồ hình 2.1. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến như sơ đồ hình 2.1
Gạo đen
Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin
Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định tỷ lệ HCl để pha dung môi tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin.
Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm
34
2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.
Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu tấm gạo đen bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (còn gọi là phương pháp nhiệt).
2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen
Mục đích thí nghiệm: Xác định bước sóng λmax của mẫu trong dung môi EtOH:HCl 0,1N (85:15,v:v). Chọn độ pha loãng thích hợp để thực hiện pha loãng mẫu ở các thí nghiệm tiếp theo.
Cặn Gạo đen
Trích ly ggggg Ly tâm
Thu dịch
Dung môi
Lọc
Nhiệt độ 60oC Thời gian 60 p TL 1:20 (w:v)
4000 rpm 15 phút
EtOH:HCl 1%
85:15 v:v
Định mức
Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến Xác định các
thông số tối ưu Định lượng anthocyanin
35 Chuẩn bị thí nghiệm:
- Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen.
- Ta pha loãng mẫu với độ pha loãng lần lượt từ n=10,20,30 bằng EtOH : HCl 0,1N (85:15,v:v). Trong vùng bước sóng từ 400 - 700nm.
Chỉ tiêu theo dõi: Phổ hấp thu của dịch trích ly. Xác định λ max.
2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra kích thước hạt của gạo đen cho hiệu quả trích ly cao nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Chuẩn bị gạo đen với các kích thước hạt: nguyên hạt, xay và rây đến 0,0098 và 0.346 inches.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm với 1 yếu tố và 3 lần lặp lại. Yếu tố thí nghiệm là kích thước hạt.
Tổng số nghiệm thức là 3:
+ Nguyên hạt
+ Xay và rây đến kích thước 0.0098 inches + Xay và rây đến kích thước 0.346 inches
36
4000 rpm 15 phút Nhiệt độ 60oC Thời gian 60 p TL 1:20 (w:v)
Cặn Gạo đen
Trích ly ggggg Ly tâm
Dung môi
Thu dịch
Lọc
Chọn kích thước tối ưu
Nghiền nhỏ ggggg 0,0098
inches
0,346 inches Nguyên
hạt
EtOH:HCl 1%
85:15 v:v
Định mức
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Định lượng anthocyanin
37 Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin.
2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Mục đích thí nghiệm: So sánh và chọn ra nhiệt độ xử lý nguyên liệu cho hiệu quả thu hồi anthocyanin cao nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
-Mẫu gạo đen đã nghiền sẵn đến kích thước được lựa chọn từ thí nghiệm 1.
-Chuẩn bị hệ dung môi Ethanol: HCl 1% (85:15, v/v).
-Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
-Tỷ lệ nguyên liệu : nước để nấu cách thủy là 1:1,5 (w/v).
-Sau giai đoạn xử lý này, các bước tiến hành như sơ đồ hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Yếu tố thí nghiệm là nhiệt độ xử lý nguyên liệu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bao gồm:
- Nguyên liệu không qua xử lý nhiệt.
- Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 80oC/5 phút.
- Nguyên liệu được nấu cách thủy ở 90oC/5 phút.
38
Cặn
Nhiệt độ 60oC Thời gian 60 p TL 1:20 (w:v)
Gạo đen
Trích ly ggggg
Dung môi
Ly tâm
4000 rpm 15 phút
Nghiền nhỏ ggggg
80oC/5p ggggg
90oC/5p ggggg Nhiệt độ
phòng/5p
Lọc Thu dịch
0,0098 inches
Xử lý nhiệt ggggg
EtOH:HCl 1%
85:15 v:v
Chọn chế độ xử lý nhiệt
Định mức
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu Định lượng
Anthocyanin
39
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai.
2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát và tìm ra tỷ lệ dung môi thích hợp cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
Thí nghiệm 3 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1 và 2 sau khi chọn ra được kích thước hạt và nhiệt độ xử lý nguyên liệu.
Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm với 1 yếu tố là tỷ lệ dung môi. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Khảo sát 6 tỷ lệ dung môi Ethanol:HCl 1% (v/v) như hình 2.5
40
Cặn
0,0098 inches Nhiệt độ 60oC Thời gian 60 p TL 1:20 (w:v) 4000 rpm 15 phút
Trích ly ggggg
Dung môi
Ly tâm
Lọc Thu dịch
Gạo đen
Nghiền nhỏ ggggg
TL 98:2 TL 95:5
TL 99:1 TL 85:15 TL 80:20
TL 90:10
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Chọn tỷ lệ HCl tối ưu
Định mức
Định lượng Anthocyanin
41 Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng anthocyanin.
2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ tối ưu cho hiệu quả trích ly anthocyanin cao nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Thí nghiệm 4 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2 và 3. Sau khi chọn ra được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu và tỷ lệ HCl để pha chế dung môi thích hợp.
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Khảo sát 5 điểm nhiệt độ như sơ đồ hình 2.6
42
Cặn
Thời gian 60 p TL 1:20 (w:v)
Trích ly ggggg
Dung môi
Ly tâm
Lọc Thu dịch
Gạo đen
Nghiền
EtOH:HCl 1%
95:5, v:V
70oC 65oC 55oC 50 oC
60oC
0,0098 inches
4000rpm 15 phút
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen
Chọn nhiệt độ trích ly Định mức
Định lượng Anthocyanin
43 Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin.
2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen.
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra thời gian trích ly anthocyanin mang lại hiệu quả cao nhất.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Thí nghiệm 5 được tiến hành trên cơ sở thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Sau khi chọn ra được kích thước hạt, nhiệt độ xử lý nguyên liệu, tỷ lệ dung môi thích hợp và nhiệt độ trích ly thích hợp.
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly là 1:20 (w/v).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Khảo sát 5 khoảng thời gian như hình 2.7
44
Cặn
Nhiệt độ 55oC TL 1:20 (w:v)
Trích ly ggggg
Dung môi
Ly tâm
Lọc Thu dịch
Gạo đen
Nghiền
EtOH:HCl 1%
95:5, v:V
70 phút 65 phút 55 phút 50 phút
60 phút
0,0098 inches
4000rpm 15 phút
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen Chọn thời
gian trích ly Định mức
Định lượng Anthocyanin
45 Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng anthocyanin.
2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin.
Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH và lập đường chuẩn xác định giá trị IC50 của anthocyanin và Ascorbic acid.
Chuẩn bị thí nghiệm:
Dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.
Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:2 (w/v).
Bố trí thí nghiệm:
Bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo S.D.Sanja et al. (2009).
Lấy lần lượt 100 àl, 120 àl, 140 àl, 160 àl, 180 àl, 200 àl dịch trớch ly vào 6 ống nghiệm. Thờm đến 3000 àl bằng EtOH 100%. Rồi bổ sung 150 àl DPPH vào từng ống nghiệm làm dung dịch mẫu (mẫu). Để trong tối 15 phút, nhiệt độ phòng.
Đem đo phổ hấp thu ngay ở bước sóng 516nm. Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.
Lấy 150 àl DPPH thờm 2850 àl EtOH 100% đo phổ hấp thu ngay ở bước súng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.
Lấy 150 àl vitC (100àg/ml) thờm 2850 àl EtOH 100% đo phổ hấp thu sau 15 phút (trong tối, nhiệt độ phòng) ở bước sóng 516nm (Blank). Lấy EtOH 100% để làm mẫu trắng.
Tiến hành thí nghiệm:
- Xác định nồng độ anthocyanin trong dịch trích sau khi pha loãng 10 lần.
- Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ khác nhau, cho phản ứng với DPPH ở nhiệt độ phòng, trong tối, 15-30 phút rồi tiến hành đo OD tại 516nm. Sử dụng chất đối chứng là Ascorbic acid (100àg/ml).
46 Chỉ tiêu theo dõi:
Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.
Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.
2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thông số cho quá trình cô quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô đặc.
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian cô quay. Cô quay đến thể tích bao nhiêu là tối ưu nhất. Đồng thời xác định hàm lượng anthocyanin sau khi cô quay.
Chuẩn bị thí nghiệm:
- 700 ml dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trong 24h bảo quản ở 4oC.
- Tỷ lệ mẫu:dung môi trích ly là: 1:20 (w/v).
Tiến hành thí nghiệm:
-Cân khối lượng bình cô quay khô, m.
-Cân lại khối lượng bình sau khi cho 100mL mẫu vào, m0.
-Tiến hành cô quay lần lượt 6 bình chứa dịch trích ly cùng thể tích là 100ml.
-Nhiệt độ cô quay là 40oC.
-Cân lại khối lượng các bình 3 phút, bình 6 phút, bình 9 phút, bình 12 phút, bình 15 phút, bình 18 phút cô quay ta được khối lượng mo, m3, m6, m9, m12, m15, m18. Sau đó định mức lại 100 (ml) mẫu đem xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính kháng oxy hóa.
Chỉ tiêu theo dõi:
Hoạt tính oxy hóa: Đo độ hấp thu màu của lượng DPPH còn lại sau khi phản khi với anthocyanin ở bước sóng 516nm.
Nồng độ anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai.
47
Thể tích dịch dịch trích ly còn lại xác định bằng tỷ lệ khối lượng mẫu trước và sau cô quay.