1.2. Biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật
1.3.6. Đặc tính của NPV
Kích thước nhỏ, dưới 1,4 chiều dài của sóng ánh sáng, nên các dụng cụ quang học cổ điển không nhìn thấy được.
- Ký sinh trong tế bào, chỉ sinh sản, phát triển trong tế bào vật chủ, làm thay đổi đặc tính của tế bào vật chủ, hủy hoại chúng làm cho vật chủ chết.
Trang 31
- Chúng có thành phần hóa học có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch xác định được trên các cơ thể vật chủ.
- Chúng có khả năng biến đổi khi có thể chuyển đổi.
Hình 1.10 : Ảnh kính hiển vi điện tử đại diện các nhóm virus côn trùng.
1. MNPV của Lymantra dispar x 2940 lần
2. MNPV của Autographa californica x 2940 lần 3. SNPV của Helicoverpa zea x 5000 lần
4. MNPV của Lymantra dispar x 5000 lần 5. SNPV của Helicoverpa zea x 27150 lần 6. MNPV của Lymantra dispar x 19820 lần 7. GV của Plutella xylostella x 12500 lần 8. GV của Cnaphalocrocis x 29675 lần 9. Hạt virus Oryctes rhinoceros x 200000 lần
10. Lát cắt của hạt virus Oryctes rhinoceros x 135000 lần 1.3.7. Cơ chế xâm nhiễm của virus NPV
Trang 32
Theo Vũ Mai Nam (2001) khi giải thích về cơ chế xâm nhiễm của NPVs như sau: virus SpltNPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua thức ăn, vào đến ruột giữa do tác động của dịch ruột, vỏ protein vỡ ra. Sâu bị nhiễm có màu trắng bệch, lờ đờ. Hai hoặc ba ngày sai khi bị nhiễm, sâu không ăn, nằm bất động cho đến khi cơ thể sưng lên, vỡ dịch chảy ra ngoài và sâu chết hẳn.
Thời gian từ lúc virus xâm nhập vào cơ thể cho đến khi sâu chết thay đổi tùy theo tuổi và loài sâu thường kéo dài từ 3-12 ngày. Cơ chế giết sâu là ký sinh trên ký chủ và bắt đầu quá trình ký sinh khác làm bệnh lây nhiễm nhanh chóng và lan rộng không ngừng. Mặt khác, xác sâu chết trở thành thức ăn cho sâu sống vì thế sự lây nhiễm càng nhanh hơn (Vũ Mai Nam, 2001).
Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non, cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá trình hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau:
khi vào ruột các thể vùi PIB của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình này trải qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể vùi polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu.
- Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần.
- Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt và đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi. Giai đoạn này kéo dài 2-5 ngày.
Trang 33
Sâu tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus. Nhưng sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn, vì quá trình ủ bệnh còn phụ thuộc vào tuổi sâu, điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và lượng thức ăn khi lây nhiễm... Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể khác.
Sâu ăn lá cây bị nhiễm virus
Các thể vùi virus hiện diện trong lá
Hệ tiêu hóa trong ruột giữa của sâu
Các phân tử virus được phóng thích ra khỏi thể vùi và đến gắn vào mao mạch của vách ruột
Sự nhân một số virus trong tế bào sâu Virus
Thể vùi Khoang máu
Nhân tế bào Tế bào
Dịch ruột Lá cây
1.3.8. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus
Hình 1.11 Sơ đồ lây nhiễm, xâm nhập và phát triển của NPV trong cơ thể sâu chủ
Trang 34
Phần lớn các thể vùi của NPV, GV, CPV được giải phóng từ cơ thể sâu bị bệnh đã rã xuống đất hoặc bám trên các bộ phận của thực vật tạo thành những nguồn virus lan truyền bệnh. Những thể vùi của virus cùng thức ăn xâm nhập vào ruột côn trùng. Tại ruột côn trùng dưới tác động của các men tiêu hóa, thể vùi bị hòa tan và giải phóng các virion. Qua biểu mô ruột giữa virion xâm nhập vào dịch máu, tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong các tế bào để sinh sản và gây bệnh cho vật chủ.
Theo Chu Thị Thơm el al. (2006), việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng xảy ra theo 2 hướng:
- Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế hệ trong điều kiện bệnh phát thành dịch, nguồn virus có thể bám bên ngoài vỏ trứng của vât chủ. Khi trứng nở, ấu trùng gậm vỏ trứng chui ra và nhiễm nguồn bệnh.
- Lây truyền dọc: là truyền nguồn bệnh qua trứng (qua phôi).
Ngoài ra trong một số trường hợp virus có thể xâm nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua các vết thương trên cơ thể (qua vết chọc đẻ trứng của ong kí sinh, lỗ xâm nhiễm của một số ấu trùng kí sinh vào bên trong cơ thể).
1.3.9. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu ăn tạp
Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi nhận các triệu chứng như sau:
- Dạng 1: sâu có màu trắng sang đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên, da dễ vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi.
- Dạng 2: sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi hoặc có mùi hôi.
- Dạng 3: sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ rách ở các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi.
Sâu non sau khi bị nhiễm bệnh thì sức ăn giảm, động tác chậm, thường bò lên trên cao, cơ thể trước lúc chết bị mềm, các mô trong cơ thể chứa nhiều nước, da dễ
Trang 35
bị nứt, chảy ra dịch màu trắng hoặc nâu, chưa có mùi hôi, cho đến khi có nấm mốc mọc mới có mùi. Sâu non bị chết thường có đuôi bám chặt vào cành cây, thân rũ xuống, dịch chảy xuống dưới làm cho phần cơ thể phía trước phình to lên. Dịch trong thân chứa nhiều NPV. Sau khi nhiễm bệnh thường trải qua 4 ngày mới chết, một số kéo dài đến 24 ngày (Trần Văn Mão, 2002).
Nhộng sâu ăn khoang tạp bị nhiễm NPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng, rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng sinh sản giảm và truyền virus sang trứng.
Trên đồng ruộng, dịch chứa virus có thể lan qua cây trồng và bị ăn bởi các con sâu khác. Sâu sẽ chết trong vòng 4-7 ngày sau khi nhiễm virus (Shepard B. M., 2009).
Theo mô tả của Jayarasjs (1985):
- Trong thời gian 2-3 ngày đầu của thời kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh không có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn.
- Các ngày sau, các đốt thân của sâu non căng phồng và mọng nước dần, sâu chuyên động nhiều.
- Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ.
- Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây chúc đầu xuống phía dưới.
- Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết.
- Dịch trắng không có mùi hôi.
- Thời gian từ khi cơ thể mọng nước đến khi sâu chết không quá 1 ngày.
Theo nghiên cứu của Abbas, M.S. et al (1988), thời gian ủ bệnh NPV của sâu khoang thường là 4 - 10 ngày. Đối với nhộng, trong thời kỳ ủ bệnh,triệu chứng bệnh không rõ, nhưng vào giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thân nhộng xuất hiện màu đục, da dễ vỡ, dịch trắng không có mùi hôi chảy ra và nhộng chết. Sâu trưởng thành bị bệnh vào giai đoạn cuối da cũng bở, dễ vỡ và có dịch trắng chảy ra.
Trang 36
1.3.10. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại
1.3.10.1. Ưu điểm của chế phẩm NPV
Theo Szewczyk et al. (2009), Baculovirus chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác và sẽ bị bất hoạt khi chúng xâm nhập vào tế bào động vật. Điều này có nghĩa là Baculovirus không làm ô nhiễm môi trường sống, không gây ngộ độc thuốc hay lưu tồn,… như khi sử dụng thuốc hóa học.
Baculovirus là chủng có tính chọn lọc ký chủ rất cao so với các nhóm virus thiên địch khác (Frances et al., 1998) do đó mà không làm hại đến các loài côn trùng có ích khác như thuốc hóa học.
Baculovirus có cấu trúc với thể bọc bảo vệ, tránh các yếu tố bất lợi của môi trường nên có thể duy trì khả năng sống trong tự nhiên ngoài cơ thể vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Cũng theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) thì Baculovirus rất thuận lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng (1010 virus/ấu trùng). Chế phẩm có thể giữ hoạt tính trong thời gian rất dài (10 - 15 năm) ngoài cơ thể côn trùng.
1.3.10.2. Nhược điểm của chế phẩm NPV
Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây thối.
So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Ngoài ra chế phẩm virus còn gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Do Baculovirus rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm virus cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên.
Trang 37
Vì là tác nhân sinh học nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm,…) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học. Một khuyết điểm khác nữa là trong điều kiện tự nhiên, các loài sinh vật có thể tiêu diệt lẫn nhau làm giảm tác động của thuốc trong việc phòng trừ dịch hại (Quang Chân Chân, 2002).
1.3.11. Hiệu quả diệt sâu của virus NPV
Việc nghiên cứu, xác định LC50 được thực hiện với nhiều chủng virus NPV. Sử dụng baculovirus Spilarctic obliqua nucleopolyhedrosis virus trong việc phòng trừ Porthesia xanthorrhoea gây hại dâu R.Varatharajan, M.Ingobi Singh & Lreeta (2006) cho biết. Spilarctic obliqua nucleopolyhedrosis virus (SoNPV) được sử dụng có hiệu quả trong việc phòng trừ S. obliqua cũng như Porthesia xanthorrhoea. Các tác giả cũng đã xác định được LC50 của SoNPV đối với sâu S. obliqua ở nồng độ là 2,5 x 104 PIB/ml và của P. xanthorrhoea ở nồng độ là 3,7 x 104 PIB/ml. LT50 của SoNPV dùng để phòng trừ S. oblique là 5,73 ngày và P. xanthorrhoea 6,89 ngày. Bằng cách lây nhiễm SoNPV trong việc phòng trừ P.xanthorrhoea có thể dễ dàng dùng để sản xuất một lượng sinh khối lớn cho việc sản xuất thuốc trừ sâu.
Hiệu lực của SpltNPV dùng để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau được thực hiện bởi B.S.Ravishankar và M.G.Venkatesha (2010).
Các tác giả thực hiện 3 thí nghiệm để xác định mức độ ảnh hưởng của NPV đến các loài cây ký chủ. Cụ thể như sau: Thí nghiệm đầu tiên nuôi sâu non Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau và khi tới tuổi 2 thì thay bằng thức ăn nhân tạo được lây nhiễm ở các nồng độ khác nhau. Giá trị LC50 của NPV đối với sâu Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau như sau: bắp cải 0,42;
bông 0,61; khoai tây 0,75; lạc 0,93 và hoa hồng 1,28 PIB/mm2. Trong thí nghiệm 2, Spodoptera litura được nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo cho đến tuổi 2 và sau đó được cho ăn trên các cây ký chủ khác nhau khi đã nhiễm SpltNPV. Giá trị LC50
trên hoa hồng là cao nhất 1,81; tiếp theo là lạc; khoai tây; bông và bắp cải (0,40 PIB/ml). Trong thí nghiệm 3 Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau cho đến tuổi 2 và sử dụng phương pháp nhúng lá để đánh giá LC50. Giá trị LC50
Trang 38
tăng theo thứ tự là lạc, khoai tây, bông và bắp cải (1,02 PIB/ml). Trong cả 3 thí nghiệm trên thì LC50 của bắp cải là thấp nhất và của hoa hồng là cao nhất.
Xác định LC50 của NPV trong trường hợp có trộn thêm acid boric để tăng cường khả năng diệt sâu Lauro Morales và cộng sự (1997). Nồng độ boric acid (0,02; 0,03; 0,045; 0,067 và 0,101 g/ml) được kết hợp với AgNPV làm tăng hiệu lực diệt sâu. Bảy ngày sau khi nhiễm nồng độ gây chết trung bình 50% (LC50) là 1,52 x 105 chỉ có AgNPV và 7,95 x 102 khi phối trộn AgNPV với 0,045 g/100ml boric acid. Quan sát các ngày sau khi nhiễm (9,11 đến 14 ngày) thì LC50 của hổn hợp NPV + boric acid thấp hơn 4 lần khi chỉ có NPV. Thời gian gây chết trung bình 50% (LT50) là 13,6 ngày khi chỉ có NPV, trong khi đó hổn hợp NPV + boric acid thì giá trị LT50 giao động từ 13,7 ngày (boric acid 0,02 g/100ml) đến 7,4 ngày (boric acid 0,101 g/ml). Do đó có thể bổ sung boric acid vào AgNPV để tăng hiệu lực diệt sâu A. gemmatalis và rút ngắn thời gian tử vong bởi các tác nhân gây bệnh.
Kết quả nghiên cứu NPV và hiệu quả của sự kết hợp NPV với thuốc hóa học để phòng trừ sâu ăn tạp Spodoptera litura Trần Thị Kiều Trang và S. Chaudhari (2002). Sử dụng NPV để phòng trừ sâu hại là một trong những biện pháp tối hảo trong chường trình IPM, NPV là một trong những nhóm phụ của họ Baculovirus được xem như một loại thuốc sinh học với tính chuyên biệt cao đối với nhiều loài sâu hại thuộc họ Lepidoptera. Nồng độ sử dụng tùy thuộc nhiều vào độ tuổi của sâu. Sâu 2 ngày tuổi sẽ bị nhiễm nhanh gấp 1500000 lần so với sâu ở 8 ngày tuổi, thời gian yêu cầu để 50% sâu chết gia tăng với tuổi sâu. LT50 tăng từ 4,4 ngày đối với sâu 2 ngày tuổi đến 9,4 ngày ở sâu 8 ngày tuổi. LT50 có sự phụ vào liều lượng, LT50 tăng khi tuổi sâu tăng, giảm khi liều lượng tăng. Sự kết hợp NPV với một số thuốc hóa học ở liều lượng cực nhỏ cho thấy có kết quả tốt như trong trường hợp NPV kết hợp với Actara và Difubenzuron cho tác dụng bỗ trợ tăng phần trăm tỷ lệ chết của sâu và thời gian gây chết được rút ngắn hơn so với sử dụng NPV đơn độc.
Từ các kết quả nhận được cho thấy tiềm năng sử dụng NPV để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài rau màu là có triển vọng tốt phù hợp với chương trình an toàn lương thực thực phẩm.
Trang 39
Nghiên cứu của Baskaran et al., (1999) khi chỉ có NPV (108 PIB/ml) và kết hợp giữa NPV ở nồng độ (2 x 104 PIB/ml) với dầu neem (1%), chiết suất từ nhân hạt neem (5%) và chiết suất từ bánh neem 5%. Kết quả cho thấy sự tăng hiệu lực NPV và tỷ lệ tử vong tăng từ 31,1% đến 81,5% và 57,6% tương ứng. Sự kết hợp giữa NPV với Vitex negundo 10% không làm tăng hiệu lực của NPV, trong khi đó Prosopis juliflora và Ipomoea carnea gây ra sự đối kháng với virus NPV. Kết hợp của virus NPV với các sản phẩm từ Neem làm giảm sự thiệt hại của sâu non gây ra và làm giảm LT50 của virus NPV. Sử dụng kết hợp của NPV với dầu neem ở các nồng độ khác nhau (0,1 - 1%) và chiết suất từ nhân hạt neem làm giảm LC50 của virus NPV tương ứng từ 1,06 - 1,43 (lần) và 1,03 - 1,33 lần.
QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỬ DỤNG NPVsl :
Dựa vào các kết quả nghiên cứu về các đặc tính và hiệu lực trừ sâu khoang của NPVsl, đồng thời dựa vào kết quả nhân nuôi thực tế, tạo sinh khối lớn tại một số phòng thí nghiệm, cho phép xây dựng quy trình sản xuất và sử dụng NPVsl (Hình 1.12).
Trang 40
Nhân ký chủ Nhân ký sinh NPVsl ĐT phòng trừ
Hình 1.12: Sơ đồ sản xuất và sử dụng NPVsl Thu nuôi sâu giống
Thu trứng
Nuôi sâu non tuổi 1-2
Nhiễm NPVsl cho sâu khoẻ
Ghép, nuôi bướm
Giữ nhộng Thu sâu chết NPVsl
Trộn phụ gia Ly tâm 500, 3000 v/ph
thu thể vùi (PIB) Nghiền, lọc sâu chết
Thu, chọn sâu tuổi 4
Nuôi sâu non tuổi 3-4
Phun NPVsl Trừ sâu khoang Điều tra mật độ
Sâu khoang
Bảo quản lạnh (- 18 đến – 200C)
Đóng chai Tiêu chuẩn hoá lượng
PIB
Đánh giá hiệu quả sử dụng
NPVsl