CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ ngày 25/06/2013 đến ngày 15/09/2013, tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học của trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Hộp nhựa lớn đựng nuôi sâu (nắp đục lỗ và lắp lưới chống côn trùng cho thông thoáng), hộp nhựa nuôi nhân nhiễm NPV, hộp nhỏ thu nhận mẫu, cọ bắt sâu, cân, đũa thủy tinh, pipep, cốc thủy tinh, bút lông ghi mẫu, bông gòn.
Các trang thiết bị khác: máy ly tâm, buồng đếm hồng cầu, tủ lạnh, kính hiển vi, bếp từ, máy xay sinh tố.
Các hóa chất: Ethanol 70%, formaldehyl 5%.
Thức ăn nhân tạo được làm theo công thức:
- Đậu xanh hạt ngâm 150 g
- Men mì 15 g
- Methyl - paraben 2,5 g
- Sorbic acid 1,5 g
- Ascorbic acid 3 g
- Vitamin tổng hợp 10 ml
- Casein 3 g
- Agar 10 g
- Nước cất 700 ml
2.1.3. Nội dung nghiên cứu
Xác định thời gian thu nhận sâu chết để thu được lượng PIBs cao nhất.
2.1.4. Quy trình nhân nuôi sâu khoang
Để sản xuất được SpltNPV, trước hết phải nuôi được sâu khoang với số lượng lớn, sâu khỏe.
Trang 42
Để sản xuất sâu khoang thì bắt sâu khoang giống ở ngoài đồng ruộng (thường thì ổ trứng). Trứng sâu sau khi nở được nuôi trong hộp nhựa và được cho ăn bằng thức ăn nhân tạo. Hằng ngày kiểm tra, bổ sung thức ăn cho sâu. Khi sâu đến 6 - 7 ngày tuổi thì có thể tách bớt sâu sang các hộp nhựa có kích thước (19,5 cm x 12 cm x 7 cm) với mật độ sâu là từ 10 đến 20 sâu.
Khi sâu vào nhộng, cho nhộng vào hộp nhựa. Mỗi hộp chưa 20 - 30 nhộng, giữ đủ ẩm cho nhộng vũ hóa.
Hình 2.1: Nhộng cho vào hộp nhựa để vũ hóa
Khi bướm vũ hóa, tiến hành ghép, mỗi cặp 1 bướm cái và 1 bướm đực thả vào lồng nuôi bướm. Dung dịch nước mật 20% và nước cất thấm vào bông được cho vào đáy lồng để bướm ăn thêm. Sau khi ghép bướm 1 - 2 ngày thì bướm đẻ tiến hành thu trứng xử lý bằng formaldehyl 5%. Sau 2 - 3 ngày thì trứng nở.
Hình 2.2: Ghép bướm sâu khoang
Trang 43
Sâu non được nuôi trên lá thầu dầu hoặc thức ăn nhân tạo cho đến tuổi cần thí nghiệm.
Hình 2.3: Nhân nuôi sâu bằng lá thầu dầu. Hình 2.4: Nuôi bằng thức ăn nhân tạo
2.1.5. Phương pháp đếm virus
Thu sâu chết giữ trong lọ (định mức đến 1 sâu/ml nước) và để ở nhiệt độ phòng cho tới khi xác sâu rữa ra.
Hình 2.5: Thu sâu nhiễm NPV
Lọc qua 2 lớp vải mỏng để loại bỏ xác sâu và tiến hành ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút, trong thời gian 5 phút. Loại bỏ phần cặn lắng phía dưới đáy ống, lấy phần nước ở trên. Ly tâm tiếp với tốc độ 6000 vòng/phút, trong thời gian 30 phút, lấy phần tinh thể trắng lắng đọng ở dưới, đó là các thể vùi PIB của NPV.
Trang 44
Hình 2.6: Lọc, loại bỏ xác sâu. Hình 2.7: Ly tâm thu NPV
Cho 1 gọt dịch virus vào buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng PIB/sâu. Đếm số lượng PIB trên 5 ô lớn (mỗi ô lớn bao gồm 16 ô nhỏ) trên buồng đếm, đếm 3 lần ở mỗi nồng độ pha loãng và ở 5 ô lớn khác nhau lấy giá trị trung bình.
Hình 2.8: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu
Công thức xác định PIB:
Số PIB trong 1 ml mẫu = A x (4000/80) x F x 1000
Trong đó: - 4000 = 400 x 10 (Error! mm2: diện tích một ô nhỏ; Error! mm:
chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamelle).
- A là tổng số PIB đếm được trong 80 ô nhỏ.
- F là hệ số pha loãng mẫu.
2.2. Tiến hành thí nghiệm
2.2.1 Mục đích : Xác định thời gian thu nhận sâu chết để thu được lượng PIBs cao nhất.
Trang 45 2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ dịch nhiễm 1,8 x 105 ; 1,8 x 106 ; 1,8 x 107 đối với sâu tuổi 4 thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần là 20 sâu.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm Tuổi sâu
nhiễm
Nồng độ dịch nhiễm ( PIB/ml )
4 1,8 x 105 1,8 x 106 1,8 x 107
2.2.3 Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm được tiến hành dựa theo phương pháp của McKInley (1985) và có cải tiến một số thao tác cho phù hợp, cụ thể như sau:
- Nguồn sâu: được lấy từ trứng của các cặp bướm nuôi được. Chọn sâu tuổi 4 để đói 2 tiếng trước khi đem nhiễm virus.
Hình 2.9: Chuẩn bị sâu thí nghiệm. Hình 2.10: Thức ăn nhân tạo để nhân nhiễm
- Thức ăn nuôi sâu: Sử dụng thức ăn nhân tạo. Đổ cẩn thận thức ăn vào trong các hộp nhựa, sao cho bề mặt thức ăn không bị rỗ để tránh sự phân bố không đều của dịch nhiễm. Thức ăn được để nguội ở nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ lạnh đến khi sử dụng mới lấy ra để tránh bị hư.
- Chuẩn bị dịch nhiễm: Nguồn virus NPV sử dụng là nguồn virus gây chết thu được từ tự nhiên và đem về nhân lên trong điều kiện thí nghiệm. Dịch virus thu
Trang 46
được sau khi lọc thô, chuẩn nồng độ cần để nhiễm 1,8 x 105 ; 1,8 x 106 ; 1,8 x 107 (nồng độ giảm dần theo số lần pha loãng 10-1).
- Nhiễm dịch: Cho vào mỗi hộp thức ăn dịch NPV và dùng chổi lông để quét đều dịch virus lên bề mặt thức ăn. Lưu ý để cho bề mặt thức ăn khô trước khi cho sâu vào.
Hình 2.11: Quét dịch virus NPV lên mặt thức ăn nhân tạo
- Mỗi nghiệm thức sử dụng 20 sâu, lặp lại 3 lần. Sâu được nhiễm với số lượng 20 con/hộp.
Hình 2.12: Sâu tuổi 4 trong môi trường thức ăn nhân tạo có nhiễm virus NPV
- Hộp nuôi sâu được để ở điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ 26 ± 10C), thay thức ăn nhân tạo và theo dõi hàng ngày để đếm số sâu chết.
2.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
- Khối lượng sâu chết bệnh NPV trong khoảng 3 ngày sau khi nhân nhiễm.( Ngày 5, 6, 7)
Trang 47 - Số lượng PIB/sâu của các công thức.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được đưa vào xử lý thống kê, bằng chương trình Microsoft Excel, Statgraphic centurion.
Trang 48