Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Bố trí thí nghiệm
2.5.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)
❖ Quan sát đại thể nấm sợi
Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 1 tuần.
Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển;
Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử…trong thời gian nuôi ủ.
❖ Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi
Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm.
Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:
mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre.
Hình 2.1.Quy trình phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh
Tần suất bắt gặp = A/B x 100
Đồ án tốt nghiệp
23
Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy.Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch.Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày).
Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử…
2.5.3. Chuẩn bị dung dịch đồng nano để làm thí nghiệm Chuẩn bị:
– Muối Đồng (II) chloride dehydrate CuCl2.2H2O 99.0% (Merck) – Chất khử: Sodium borohydride(NaBH4) 92.0% (China)
– Dung môi: nước cất
– chất bảo vệ: Polyvinylpyrrolidone (PVP, Mw = 40.000 g/mol) (China)
Quy trình thí nghiệm:
Dung dịch CuCl2.2H2O
Dung dịch PVP (gia nhiệt)
Đồ án tốt nghiệp
24
Hình 2.2.Quy trình tổng hợp hạt nano Đồng
Cân 0.17(g) CuCl2.2H2O cho vào becher + 50 ml nước cất khuấy đều; 0.19(g) NaBH4 vào becher + 25ml nước cất khuấy đều; 1.6(g) PVP vào becher + 10ml nước cất và được gia nhiệt trên máy khuấy từ.Sau đó cho dung dịch CuCl2.2H2O đã được phân tán đều vào dung dịch PVP (0,004M) đang gia nhiệt dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh nhạt.Sau đó nhỏ từng giọt dung dịch NaBH4 vào dung dịch CuCl2.2H2O + PVP sẽ xuất hiện màu đỏ, thu được dung dịch chứa nano đồng.
Đồ án tốt nghiệp
25
Hình 2.3.Dung dịch nano đồng
2.5.3 Chuẩn bị đĩa môi trường có bổ sung nano đồng để thử nghiệm (b) Đối với từng loại nấm bệnh, thí nghiệm gồm các công thức như sau:
❖ Công thức 1: đối chứng – môi trường PDA không bổ sung dung dịch nano đồng.
❖ Công thức 2: môi trường PDA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 300ppm.
❖ Công thức 3: môi trường PDA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 380ppm.
❖ Công thức 4:môi trường PGA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 450ppm.
Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 đĩa
Cách thực hiện: môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng, để nguội xuống khoảng 500C thì bắt đầu hút dung dịch nano đồng cho vào môi trường lần lượt theo liều lượng như trên. Tiến hành đổ đĩa, để cho đĩa môi trường đông lại hoàn toàn.
Đồ án tốt nghiệp
26
2.5.4. Đánh giá khả năng kháng nấm của dung dịch nano đồng ở các nồng độ - Dùng cây đục lỗ đường kính 5 mm, đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa sinh khối nấm bệnh từ đĩa nấm bệnh đã làm thuần trước đó.
- Dùng dao cấy chuyển cục thạch vừa đục xong sang đĩa môi trường (b) vô trùng đã chuẩn bị sẵn.
- Ghi chú tên nấm, ngày, giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của nấm.
Chỉ tiêu theo dõi:
– Đo đường kính tản nấm (mm) ở các ngày sau cấy đến khi tản nấm chạm thành đĩa.
– Đường kính trung bình tính theo công thức: 𝑑 =d1+ d2 2 (Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố) – Tính độ hữu hiệu của thuốc theo công thức Vincent (1927)
𝐻𝑖ệ𝑢 𝑙ự𝑐 𝑐ủ𝑎 𝑡ℎ𝑢ố𝑐 (%) = 𝐶 − 𝑇
𝐶 × 100 Trong đó:
C: Đường kính tản nấm trên môi trường không thuốc T: Đường kính tản nấm trên môi trường có thuốc