Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu
2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000).
Phân lập các chủng nấm ở Đồng Nai từ các mẫu đất.
Đối vối mẫu đất thì dùng dao vô trùng gạt bỏ lớp đất mặt và lấy mẫu đất ở độ sâu từ 5- 10cm. Các mẫu sau khi lấy xong thì được phân lập ngay trong vòng 24 giờ
2.4.1.2 phương pháp pha loãng mẫu
Cân 10 g mẫu đất,( đã nghiền nhỏ ) cho vào bình tam giác, cho thêm vào bình 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và cho vào máy lắc 200 vòng / phút lắc 20 phút, thu lấy dịch lọc ta có độ pha loãng 10 -1 .
Lắc đều rồi hút 1ml dịch 10-1 cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng ta được dung dịch pha loảng 10-2 . Tiếp tục pha loãng như thế cho đến nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6
Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lọc ở các nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 nhỏ lên đĩa petri có chứa môi trường PDA. Dùng que cấy trang dàn đều khắp bề mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục trang lên đĩa 2 và 3. Lật ngược đĩa lại rồi gói bằng giấy báo và nuôi ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày.
Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyền cho đến khi đạt độ thuần khiết thì cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm tiếp theo.
2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm 2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm
Quan sát đại thể nấm bằng cách tạo khuẩn lạc khổng lồ, cách tiến hành như sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ các ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng , lắc đều tạo dung dịch huyền phù
- Dùng que cấy móc nhúng vào dịch huyền phu rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa petri có chứa môi trường PDA .
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau:
+ Tốc độ phát triển của khuẩn lạc (đo đường kính của khuẩn lạc).
+ Hình dạng, kích thước
+ Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc (cả mặt trái và mặt phải).
+ Giọt tiết, sắc tố tiết vào môi trường (Nguyễn Thành Đạt và cộng sự, 2000).
2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm
❖ Phương pháp phòng ẩm
Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường PDA thật mỏng ( khoảng 1mm ) Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có đường kính 8 mm
Đặt một miếng thạch mỏng có kích thước 8 mm lên một miếng lam vô trùng. Cấy nấm vào xung quanh của miếng thạch, đậy lamen lên. Cho miếng lam vào giữa đĩa petri có sẵn một miếng giấy lọc hoặc bông đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng.
Đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày.
Sau 2 - 3 ngày, lấy lam kính ra, khẽ gỡ lá kính, nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như
– Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh.
– Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh bào tử, thể bình và bào tử.
❖ Phương pháp lamen nghiêng
Cấy các chủng nấm váo các đĩa petri có chứa môi trường PDA sau đó, lấy một tấm lamen vô trùng đặt nghiêng một góc 30 – 45oC so với bề mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ phòng 2- 3 ngày.
Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm như trên. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1978).
2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase).
(Tô Duy Khương, 2007)
❖ Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và cellulose bởi enzyme chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này không cho phản ứng màu với lugol.
Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh enzyme Cellulase và Chitinase của các chủng nấm khi nuôi cấy chúng trên môi trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là CMC và huyền phù chitin. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng nấm được đánh giá dựa vào đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi nhuộm màu với thuốc thử lugol.
❖ Tiến hành:
– Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày.
– Chuẩn bị môi trường: Pha nấu môi trường sinh cảm ứng rồi hấp khả trùng và đổ đĩa, để nguội để tiến hành cấy nấm
Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PGA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường khảo sát hoạt tính có chứa 1% cơ chất (CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày.
Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm để yên 5 phút, rửa lại bằng nước cất và tiến hành đo đường kính vòng phân giải.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.
2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh (Fokkema, 1976).
❖ Chuẩn bị nguồn nấm
Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh.
Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm Trichoderma
❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp
Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa môi trường PGA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh. Tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa có chứa nấm bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch.
Đĩa đối chứng: Lấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa môi trường PGA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp.
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy.
Tính tóa khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh cây trồng Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức:
Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp: R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối chứng; R2:
tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma; T: tản nấm Trichoderma trên đĩa đối kháng
R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có cấy Trichoderma (mm).
R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy Trichoderma (mm).
2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê.
-Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.
PIMG = (R1 – R2)/ R1 x 100 (%)
R1
R2
T
Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN