1.3. Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
1.3.1. Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ
Đặc điểm
17
Agrobacterium là vi khuẩn đất, nhuộm gram âm, háo khí, thuộc họ Rhizobiacea (Kerters và De Ley, 1984). Nhiều nghiên cứu đã khẳng định Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những vùng mô đang phân sinh mạnh.
Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này vì mô phân sinh là nơi mà chồi con hay rễ (đã “bị” thay đổi thông tin di truyền) có thể dễ dàng được tạo thành.
Vi khuẩn A. tumefaciens (chứa plasmide pTi – tumor inducing) có thể gây khối u dễ dàng cho cả cây khỏa tử và cây hai lá mầm nhưng lại khó khăn hơn trong việc gây khối u cho cây một lá mầm (Smith và Townsend, 1907). Lý do là cây một lá mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền của thành tế bào, hoặc khi bị thương, phần mô tại điểm đó có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm. Nhưng hiện nay người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gen cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan, ứng dụng chuyển gen tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng,…
Còn vi khuẩn A. rhizogenes (chứa plasmide pRi – root inducing) là tác nhân gây bệnh tạo rễ tóc (hairy root) cho thực vật. Nó cảm ứng kích thích tạo rễ khi xâm nhiễm vào tế bào thực vật tại điểm bị thương (Riker và cs., 1930) tạo nên bộ rễ gồm những rễ chuyển và những rễ không chuyển gen.
Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ
Đầu tiên vi khuẩn xâm nhiễm qua vết thương của mô, của cây. Sau khi di chuyển đến vết thương, Agrobacterium gắn chặt vào bề mặt tế bào thực vật. Việc các vi khuẩn gắn vào bề mặt tế bào còn được xem như phản ứng trả lời của các vi khuẩn với các hợp chất phenolic như acetosyringon và hydroxyl acetosyringon mà tế bào thực vật tiết ra. Các chất này được tiết ra khi cây bị thương và có tác động tạo vùng tế bào phân chia mạnh nhằm chữa lành vết thương, các chất phenolic sẽ hàn gắn vết thương và polymer hóa tạo lignin. Các phân tử phenolic này có tác động cảm ứng các
18
gen vir nằm trên Ti (đối với A. tumefaciens) hoặc Ri plasmide (đối với A. rhizogenes) của vi khuẩn (Birot và cs, 1987).
Các gen vir định vị trên một vùng có kích thước 35kb nằm ngoài vùng T–
DNA. Ở đây có 25 gen virsắp xếp trong 7 operon. Các sản phẩm của gen vir có tác dụng chuyển và gắn T–DNA vào genome của tế bào thực vật (Chilton và cs, 1982).
Quá trình chuyển T–DNA cũng tương tự như quá trình chuyển plasmide từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tương tác với nhau. T–DNA được chuyển ở dạng phân tử sợi đơn từ plasmide vào tế bào thực vật và được tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể. Đầu 5’ của sợi đơn T–DNA xuất phát từ bờ phải và đầu cuối 3’ ở vị trí bờ trái. Sự hình thành sợi đơn DNA được tiến hành nhờ sự cắt đặc hiệu hai vùng bờ phải và bờ trái, sự tổ hợp T–DNA vào genome tế bào chủ phụ thuộc vào một trình tự đặc hiệu định vị ở bờ phải của T–DNA, vùng bờ phải và bờ trái đều có 25 cặp base tương tự nhau, tuy nhiên việc loại bỏ bờ trái không gây ảnh hưởng đến sự gắn T–DNA vào nhiễm sắc thể tế bào chủ (Meyer và cs, 2000).
Trong quá trình cài T–DNA vào nhiễm sắc thể thực vật có sự loại bỏ một đoạn giữa DNA của nhiễm sắc thể ở điểm gắn. Ngoài ra sự cài T–DNA vào DNA thực vật xảy ra ở những vị trí ngẫu nhiên, bờ T–DNA vi khuẩn phải có được một số điểm tương đồng với DNA thực vật ở vùng cài vào. Hầu hết các gen định vị trong vùng T–DNA chỉ được thể hiện sau khi T–DNA được cài vào genome thực vật (Meyer và cs, 2000).
19
Trong vùng T–DNA của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có các gen iaaM và iaaH mã hóa cho các enzyme tổng hợp auxin (IAA). Vùng này còn chứa gen tmr còn gọi là ipt mã hóa cho các enzyme tạo ra cytokinin. Auxin và cytokinin sẽ điều khiển hình thành khối u (đối với vi khuẩn A. tumefaciens). Vùng T–DNA của vi khuẩn A. rhizogenes mang các oncogen rol A, B, C hoặc D (Jouanin và cs, 1987).
Hình 1.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium (nguồn:www.slideshare.net)