CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Định danh bằng sinh học phân tử
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi cytochrome b Bảng 3.2:Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 phút
35
94 30 giây
48 – 56 40 giây
72 1 phút
1 72 10 phút
Hình 3.11: Kết quả tối ưu phản ứng PCR
Phản ứng PCR thực hiện tốt, không có hiện tượng bị nhiễm chéo.
Từ kết quả hình 3.11 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm có cùng kích thước nhưng vạch sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 5 ứng với nhiệt độ 52,6oC cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 52,6oC được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi cytochrome b, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52oC.
400 bp
Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho mồi cytochrome b theo gradient nhiệt độ. Kích thước sản phẩm trùng khớp với công bố của Li Lian Wong (2011) là từ 416 – 436 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng PCR đã khuếch đại được đúng vùng gen cytochrome b mong muốn.
3.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm định tính ổn định của phản ứng PCR Sau khi tối ưu phản ứng PCR, ta chọn nhiệt độ tối ưu là 52,6oC. Nhằm kiểm tra sự ổn định của phản ứng PCR, ta tiến hành chạy PCR trên 30 mẫu cá Tra chọn giống Viện II cho ra kết quả như sau:
Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Số chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 94 2 phút
35
94 30 giây
52,6 40 giây
72 1 phút
1 72 10 phút
Hình 3.12: Kết quả chạy điện di
Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp đã được xác định qua thí nghiệm tối ưu phản ứng PCR, tiếp tục tối ưu hóa kiểm tra sự ổn định của phản ứng PCR như chu trình bảng 3.3.
Từ kết quả hình 3.19 cho thấy sản phẩm khuếch đại ở nhiệt độ 52,6oC cho sản phẩm gần như là đồng đều. Vạch sản phẩm đậm, rõ nét dần. Tuy nhiên ở giếng số 22, 29, 30 thì vạch sản phẩm bắt đầu mờ. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ ảnh hưởng đến kết quả PCR của mồi cytochrome b.
Kết quả chạy điện di cho thấy khi chạy 30 mẫu cá Tra chọn giống Viện II thì cho ra sản phẩm PCR là đặc hiệu. Kích thước sản phẩm của 30 phản ứng PCR đều nằm trong khoảng 400 - 430 bp. Điều này cho thấy phản ứng PCR hoàn toàn ổn định.
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát kích thước của sản phẩm PCR của cá Tra và 6 mẫu cá da trơn.
Tiến hành chạy thử nghiệm phản ứng PCR trên 06 mẫu cá da trơn khác nhau và 01 mẫu cá tra nhằm bước đầu khảo sát sự khác nhau về kích thước của sản phẩm PCR. Dựa vào kết quả này, đề tài sẽ có bước đánh giá hiệu quả sử dụng marker định danh của mồi cytochrome b.
Hình 3.13: Kết quả điện di 7 mẫu cá da trơn Mẫu 1: Cá Hú Mẫu 2: Cá Vồ đém Mẫu 3: Cá Basa Mẫu 4: Cá Xác sọc Mẫu 5: Cá Vồ cờ Mẫu 6: Cá Bông lau Mẫu 7: Cá Tra
Kích thước sản phẩm DNA của 7 mẫu cá da trơn khác nhau sau khi PCR so với vạch thang chuẩn là khoảng 400 - 430 bp. Các mẫu cá có sản phẩm DNA ngắn sẽ có khối lượng nhẹ hơn các vạch cao. Trong đó, kích thước sản phẩm DNA của cá Vồ đém là ngắn nhất, kề đó là cá Xác sọc, còn lại các mẫu cá khác có kích thước sản phẩm DNA nằm ngang nhau.
Kết quả này cho thấy cặp mồi cytochrome b chưa đủ đặc hiệu để dùng cho việc định danh các loài các da trơn bằng sinh học phân tử.
400 bp
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Dựa trên các kết quả thu được, có thể rút ra được một số kết luận sau:
Sử dụng mẫu vây đuôi để ly trích DNA cá Tra là phù hợp hơn so với mẫu thịt cá. Vì DNA thu được có độ tinh sạch cao, đồng nhất và không đứt gãy.
Mồi cytochrome b dễ dàng sử dụng với điều kiện của phòng thí nghiệm tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, sản phẩm PCR rõ, đậm nét sau khi chạy điện di trên gel agarose.
Không có sự khác biệt rõ ràng giữa cá Tra và 06 loài cá da trơn khác nếu chỉ dùng điện di trên gel agarose để xác định sự khác biệt.