Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1.1. Phương pháp cấy chuyền và giữ giống
Tiến hành cấy chuyền nấm bằng cách dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống gốc, cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng PGA bằng phương pháp chấm 3 điểm. Ủ giống ở nhiệt 25 - 28oC trong 12 ngày. Giống sau khi ủ bảo quản ở nhiệt độ 4oC [1].
2.5.1.2. Phương pháp nuôi cấy bán rắn Metarhizium anisopliae
Lấy 10 ml nước muối sinh lý vô trùng để tạo huyền phù bào tử trên môi trường thạch nghiêng. Pha loãng huyền phù bào tử đạt 107 bào tử/ml.
Cấy 1 ml huyền phù bào tử trên vào erlen 500 ml chứa 50 g môi trường bán rắn đã được hấp khử trùng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 12 ngày [1].
25 2.5.1.3. Phương pháp xác định độ ẩm Cách tiến hành:
- Sấy chén cân và nắp trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong 1 giờ. Sau đó, đặt chén vào bình hút ẩm, đậy nắp lại, để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chén cân và nắp trên cân phân tích, ghi lại kết quả, khối lượng chén cân (mo).
- Cân khoảng 2 - 5 g tùy vào mỗi loại mẫu bằng cân phân tích cho vào chén đã biết khối lượng, ghi lại kết quả của khối lượng chén cân có mẫu (m1). Đậy nắp chén. Đặt chén cân đã có mẫu vào tủ sấy, mở nắp chén, sấy khô mẫu ở nhiệt độ 105oC trong thời gian 3 giờ đến 4 giờ. Sau đó, đậy nắp chén lại, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội về nhiệt độ phòng.
- Cân mẫu sau khi tiến hành sấy mẫu, ghi lại kết quả (m2). Tiếp tục, sấy mẫu lần nữa trong vòng 2 đến 3 giờ đến khi trọng lượng không đổi [1].
- Độ ẩm được tính theo công thức:
W = x 100%
Trong đó:
W : độ ẩm (%).
mo: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g).
m1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g).
m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g).
2.5.1.4. Phương pháp đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Bào tử Metarhizium anisopliae có kích thước tương đối lớn nên có thể đếm được trực tiếp dưới kính hiển vi quang học (vật kính 40X). Buồng đếm hồng cầu có 25 ô lớn mỗi ô có 16 ô nhỏ. Thể tích mỗi ô nhỏ là 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3. Dịch bào tử được pha loãng trong nước muối sinh lý 0,85%, lắc đều, rồi cho mao dẫn vào buồng dếm, quan sát dưới kính hiển vi để xác định mật độ bào tử trong từng ô lớn. Chỉ đếm 5 ô lớn (4 ô ở góc và 1 ô ở giữa) [1].
Cách tính mật độ bào tử:
S = 0,25 x a x L x 106 (bào tử/ml).
26 Trong đó:
a: số bào tử bình quân trong 1 ô lớn (bào tử).
S: mật độ bào tử trong dịcch huyền phù (bào tử/ml).
L: số lần pha loãng dịch huyền phù bào tử.
2.5.1.5. Phương pháp thu thập sâu ăn tạp
Nguồn sâu ăn tạp thu thập từ ngoài đồng đem về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thu nhận những lá bị sâu phá hoại có xuất hiện các ổ trứng. Những lá này được giữ trong các hộp nhựa có lót giấy thấm để vệ sinh. Sau khi trứng đã nở, thu ấu trùng sâu non và tiếp tục nuôi bằng lá cải bẹ xanh cho đến khi ấu trùng đạt tuổi 3 thì tiến hành thí nghiệm [1].
2.5.1.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học
Chuẩn bị huyền phù dịch nấm: nấm sau khi tăng sinh trong các erlen 500 ml chứa 50 g môi trường sẽ được pha loãng đến mật độ 108 bào tử/ml.
Nguồn sâu ăn tạp được thu từ đồng ruộng. Chọn các cá thể sâu 3 ngày tuổi để làm thí nghiệm. Các cá thể sâu được nuôi trong các hộp nhỏ có nắp đậy. Phía dưới đáy hộp có lót giấy thấm để giữ vệ sinh. Cho thức ăn là cải bẹ xanh đã được rửa sạch và phun lên bề mặt cải đã được đặt trong mỗi hộp 1ml dung dịch huyền phù bào tử nấm, đậy nắp lại. Mẫu thử không không phun dịch huyền phù bào tử nấm mà phun nước cất vô trùng.
Ghi nhận số sâu chết ở thời điểm 2, 4, 6, 8 và 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 4 chủng nấm M. anisopliae và mẫu không. Mỗi lần lấy chỉ tiêu đều đo nhiệt độ và độ ẩm [1].
Xác định hoạt lực của nấm trong phòng thí nghiệm đối với sâu hại cây trồng theo công thức Abbott (1925).
Hoạt lực (%) = (1 - ) x 100