CHƯƠNG 2: SẢN PHẨM XÚC XÍCH FRANCFORT HEO
2.1. Nguyên liệu chính – thịt heo
Hiện nay công ty sử dụng thịt heo từ hai nguồn: nhận tại lò mổ heo của công ty và nhập khẩu một phần từ các nước có chất lượng thịt heo tốt hơn như Úc, Nhật…
2.1.2. Các chỉ tiêu cần kiểm tra
Đối với thịt heo nguyên liệu các chỉ tiêu cần kiểm tra như sau
- Vệ sinh thú y: tất cả nguyên liệu thịt đưa để chế biến đều qua kiểm soát vệ sinh thú y.
- Chỉ tiêu về cảm quan:
o Trạng thái: thịt tươi có độ đàn hồi cao, bề mặt không nhợt nhạt, không còn gân, xương, sụn, lông,
o Màu sắc: không được có màu đỏ bầm, xám, tái nhạt hoặc xanh.
o Mùi vị: không có mùi ôi của thịt biến chất, mùi gắt dầu của mỡ bị oxi hóa , không có vị mặn, chua, chát.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 23
- Chỉ tiêu sinh hóa o Độ pH:
Thịt nạc tươi: 5,6 – 6
Thịt qua bảo quản lạnh: 5,3 – 6 o Hàm lượng NH3:
Thịt tươi < 20mg/100gr
Thịt qua bảo quản lạnh < 40mg/100gr o Hàm lượng H2S: âm tính
o Không có hàn the - Các chỉ tiêu vi sinh vật
o Tổng vi khuẩn hiếu khí < 106 khuẩn lạc/gr
o E.Coli < 100 khuẩn lạc/gr
o Staphylococcus aureus < 100 khuẩn lạc/ gr
o Salmonella <0
- Dư lượng kim loại nặng:
Bảng 2.1: Các chỉ tiêu dư lương kim loại nặng của thịt đông lạnh:
Tên chỉ tiêu Giới hạn tối
đa (mg/kg)
1. Chì (Pb) 0,5
2. Cadimi (Cd) 0,05
3. Thuỷ ngân (Hg) 0,03
- Các chỉ tiêu ký sinh trùng:
Bảng 2.2: Các chỉ tiêu ký sinh trùng của thịt đông lạnh:
Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa
1. Gạo bò, gạo lợn(Cysticercus csuitsae;
Cysticercus bovis...) không cho phép 2. Giun xoắn (Trichinella spiralis)
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 24
- Dư lượng thuốc thú y:
Bảng 2.3: Các chỉ tiêu dư lượng thuốc thú y của thịt lạnh đông:
Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa (mg/kg)
1. Họ tetracyclin 0,1
2. Họ cloramphenicol Không phát hiện
- Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật:
Bảng 2.4: Các chỉ tiêu dư lương thuốc bảo vệ thực vật của thịt đông lạnh:
Tên chỉ tiêu Yêu cầu (mg/kg) 1. Cabaryl 0.0
2. DDT 0.1
3. 2,4D 0.0
4. Lindan 0.1 5. Triclorfon 0.0 6. Diclovoc 0.0 7. Diazinon 0.7 8. Fenclophos 0.3 9. Clopyrifos 0.1 10.Cuomaphos 0.2
2.1.3. Các phương pháp xác định thịt tươi
2.1.3.1. Thử định tính khả năng sinh Hydrosulphua (H2S) - Phương pháp tiến hành
Các loại môi trường có thể sử dụng cho thử nghiệm sinh là KIA ( Kigle Iron Agar), TSI (Triple Sugar Iron Agar), SIM (Sulfide Indol Motility Agar), PIA (Peptone Iron Agar), BSA (Bismuth Sulfile Agar). Tất cả các môi trường này được hấp khử trùng
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 25
ở 1210C trong 15 phút và được phân phối vào các ống nghiệm vô trùng để làm ống thạch nghiêng (môi trường KIA, TSI) hoặc thạch đứng (môi trường SIM, PIA) hoặc vào các đĩa Petri vô trùng (môi trường BSA) dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng, ống thạch đứng hoặc cấy hoặc cấy lên mặt đĩa Petri. Sau khi cấy giống vào các ống môi trường hoặc đĩa petri được ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày khi cần thiết.
Ngoài ra thử nghiệm này có thể được thực hiện bằng cách dùng giấy tẩm acetate chì 5% gắn lên thành ống môi trường lỏng. Phương pháp này hạn chế độc tính của ion sắt, chì lên sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật kiểm định, mặt khác có độ nhạy cao (phát hiện H2S ở mức 0,01M). Trong trường hợp này, việc kết hợp giữa cấy lượng sinh khối lớn vào trong môi trường và sử dụng giấy tẩm acetate chì làm chỉ thị có thể cho kết quả trong vòng 30 phút hoặc 1 – 2 giờ đối với hầu hết vi sinh vật sinh H2S.
- Đọc kết quả:
Thử nghiệm khả năng sinh H2S là (+) khi xuất hiện màu đen trong các môi trường KIA, TSI, SIM, PIA, khuẩn lạc màu đen trong môi trường BSA hoặc xuất hiện màu nâu đen trên giấy tẩm acetate chì. Thử nghiệm là ( - ) khi môi trường không có sự xuất hiện hoặc chuyển màu đen.
2.1.3.2 Định tính NH3 (phản ứng Eber) - Nguyên lý
Nếu trong thịt có NH3 tự do, ở môi trường HCl, NH3 sẽ kết hợp với HCl - Tiến hành thử
Cho vào Erlen 10 – 15 ml thuốc thử Eber. Treo len móc sắt 1 miếng thịt khoảng 5g.
Miếng thịt phải ở giữa bình và đặt cách thuốc thử 1- 2 cm. Quan sát xung quanh miếng thịt thấy xuất hiện khói mù trắng dày đặc NH4Cl thì có hàm lượng NH3 cao
thịt kém chất lượng, ngược lại là thịt tươi.
2.1.3.3. Xác định pH - Chuẩn bị mẫu
o Phép đo không phá hủy: Chọn một vị trí đại diện cho mẫu thử để đo pH.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 26
o Phép đo phá hủy
Đồng hóa mẫu thí nghiệm bằng thiết bị đồng hóa. Cần khống chế để nhiệt độ của mẫu không vượt quá 250C. Nếu sử dụng máy xay thì phải sử dụng quá trình xay ít nhất 2 lần.
Cho mẫu đã chuẩn bị cho vào vật chứa có nắp đậy kín, phù hợp. Đậy nắp vật chứa lại và bảo quản trong điều kiện thích hợp để tránh làm hư hỏng mẫu hoặc làm biến đổi thành phần mẫu thử. Tiến hành phân tích mẫu càng sớm càng tốt, nhưng thường trong vòng 24h sau khi đã đồng hóa.
- Cách tiến hành
o Hiệu chuẩn pH –met
Sử dụng 2 dung dịch đệm có giá trị pH gần bằng nhau nằm, trong khoảng pH dự kiến của mẫu thử tại nhiệt độ đo để hiệu chuẩn pH met hiển thị bằng kỹ thuật số hoặc kỹ thuật tương tự, với độ chính chính xác 0,01đơn vị pH, trong suốt quá trình hiệu chuẩn phải khuấy dung dịch đệm bằng máy khuấy.
Nếu pH met không có hệ thống hiệu chỉnh nhiệt độ, thì nhiệt độ của dung dịch đệm phải nằm trong khoảng ( 20 ± 2)0C.
Đối với các sản phẩm đã qua đồng hóa, trình tự tiến hành đo dung dịch chiết của mẫu.
Đối với phép đo không phá hủy, trình tự tiến hành đo trực tiếp trên mẫu.
o Phần mẫu thử
Sử dụng máy đồng hóa kiểu trục quay (có thể hoạt động với tần số quay là 20 000 vòng/phút). Để đồng hóa một lượng mẫu thử đã chuẩn bị với một lượng dung dịch Kali clorua nhiều gấp 10 lần khối lượng mẫu.
Cách chuẩn bị dung dịch Kali clorua là hòa tan 7,5g Kali clorua trong bình định mức một vạch dung tích 1000ml, pha loãng bằng nước đến vạch và lắc. (Nếu dùng để đo pH của thịt trước giai đoạn chết cứng , cần thêm 915 mg acid iodoaxetic cho mỗi lít dung dịch để đình chỉ sự thủy phân glycogen, chỉnh pH của dung dịch đến 7,0 bằng dung dịch Natri hidroxit).
Đo dung dịch chiết mẫu
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 27
Đặt các điện cực vào mẫu chiết và hiệu chỉnh hệ thống đặt nhiệt độ của pH – met cho phù hợp với nhiệt độ của mẫu chiết. Nếu pH – met không có hệ thống chỉnh nhiệt độ thì phải duy trì nhiệt độ của mẫu chiếc trong khoảng 200C ± 20C.
Trong khi khuấy bằng máy khuấy, đo độ pH sử dụng quy trình thích hợp đối với pH – met, đọc trực tiếp giá trị pH trên dụng cụ đo, chính xác đến 0,01 đơn vị pH khi đạt giá trị không đổi.
Sử dụng lần lượt các mảnh vải len hoặc vải bông lần lượt thấm Dietyl ete và Etanol ( C2H5OH 95% phần thể tích) để lau sạch các điện cực, sau đó rửa lại bằng nước cất và bảo quản chúng theo chỉ định của nhà sản xuất.
Đo trực tiếp trên mẫu
Dùng dao sắc hoặc dụng cụ sắc nhọn khoét hoặc đục một lỗ có kích thước vừa khít với cực điện khi đặt vào.
Đặt hệ thống điều chỉnh của pH – met đến nhiệt độ mẫu cần đo. Nếu pH – met không có hệ thống chỉnh nhiệt độ phải duy trì nhiệt độ của mẫu chiếc trong khoảng 200C ± 20C.
Đo độ pH sử dụng quy trình thích hợp đối với pH – met. Đọc trực tiếp giá trị pH trên dụng cụ đo, chính xác đến 0,01 đơn vị pH khi đạt giá trị không đổi.
Khi đo pH của thịt tươi ở nhiệt độ từ 00C đến 50C, sử dụng pH – met có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ nếu cần.
Lặp lại phép đo trên cùng một điểm vạch ban đầu.
Lặp lại các phép đo tại nhiều điểm khác nhau nếu cần phải xác định sự chênh lệch giá trị pH tại các điểm khác nhau của mẫu.
- Tính toán và biểu thị kết quả.
o Phép đo không phá hủy
Lấy kết quả là giá trị trung bình số học của hai giá trị pH đo được tại mỗi giá trị đo. Đọc giá trị pH trung bình số học tại mỗi giá trị đo, chính xác đến 0,05 đơn vị pH.
Khi thực hiện các phép đo tại nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cần lập sơ đồ và ghi lại các điểm đo cùng với các giá trị pH trung bình tương ứng đo được.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 28
o Các sản phẩm đã được đồng hóa: Đọc kết quả chính xác đến 0,05 đơn vị pH.
2.1.3.4 Xác định hàm lượng chì - Chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn trộn đều, cân 10g vào chén nung, thêm 5ml Magienitrat 2% khuấy đều, sấy khô, lúc đầu ở 1200C đến khô, thêm 5ml acid nitrit 1%, lại sấy khô, sau đó đưa vào lò nung. Nâng dần nhiệt độ từ 3000C đến 5500C, cứ 50 phút tăng 500C, đến khi đạt 5500C thì giữ trong 2 giờ liên tục.
Lấy tro thu được tẩm ướt bằng nước cất, thêm 8ml acid clohydric, 5 giọt acid nitrit 65%, đun nhẹ cho tan hết, làm bay hơi để đuổi acid dư, thêm 1ml lantanclorua 10% rồi chuyển sang dung dịch này vào bình đựng mức, và định mức bằng acid clohydric 1% đến thể tích 20ml (có thể đến 10ml). Dung dịch này dùng để xác định chì.
Nếu dung dịch mẫu trên không phát hiện được chì thì cân lượng mẫu lớn hơn và chiết để làm giàu bằng MIBK có sự có mặt của thuốc thử ADPC 2% ở môi trường pH ~ 3 để chiết chì vào hữu cơ, sau đó tách lấy pha hữu cơ, để xác định chì. Ở đây mẫu phân tích và mẫu chuẩn phải cùng chiết vào MIBK trong cùng điều kiện thí nghiệm.
- Pha dãy chuẩn
Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của chì nồng độ 1mg/ml pha loãng và định mức bằng acid clohydric 1%, tính lượng phù hợp để pha dãy chuẩn có nồng độ : 1 – 2 – 4 – 6 – 8 /ml trong thể tích 25ml như bảng dưới đây:
C1 C2 C3 C4 C5 Nền lantanclorua (%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Magienitrat (%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Acid clohydric (%) 1 1 1 1 1
Chì /ml 1 2 4 6 8
- Chuẩn bị mẫu trắng
Đồng thời với việc chuẩn bị phân tích mẫu phải chuẩn bị thêm mẫu trắng để so sánh. Mẫu trắng được như mẫu phân tích nhưng không có mẫu phân tích.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 29
- Các điều kiện thực nghiệm
o Vạch phổ đo của chì 283,3nm hay 217nm o Khe đo máy AAS là 0,5 nm
o Buner loại khe dài: 10 cm
o Cường độ đèn catot rỗng : dùng 70% giá trị cực đại o Hỗn hợp khí : không khí nén và axetylen 4,2/1,2 l/phút o Tốc độ dẫn mẫu 15ml/phút
o Thời gian đo 10 giây
o Các điều kiện khác chọn phù hợp theo máy AAS - Tiến hành thử
o Đặt các thông số đã chọn cho máy để đo chì o Cho máy chạy ổn định (15 phút)
o Đo phổ hấp thụ của chì ở lần lượt từ các mẫu chuẩn, mẫu trắng, rồi đến mẫu phân tích. Mỗi mẫu đo 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của 3 lần thử đồng thời có sai lệch nhưng không vượt quá 15%.
o Hiệu chỉnh giá trị của mẫu trắng (nếu có)
o Dựng đường chuẩn theo hệ tọa độ D – C, trong đó D là cường độ của vạch hấp thụ của chì trong các mẫu chuẩn tương ứng với các nồng độ Cx của nó trong dãy chuẩn.
o Xác định nồng độ Cx của chì theo đường chuẩn trên - Tính kết quả
Hàm lượng của chì trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau C0 = (Cx . V. F) /a tính bằng /g
Trong đó a là gam mẫu thịt cân để xử lý và định mức thành thể tích Vml. (như trên V = 20ml) , F là hệ số pha loãng mẫu khi đo. Nếu không pha loãng thì F = 1
2.1.3.5. Xác định thủy ngân - Chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều, cân 10g (bằng cân phân tích), cho vào bình Kjeldahl, thêm dần 10 – 15 ml Acid Sunfuric 98% vào và
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 30
lắc trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 50 – 600C, cho đến khi mẫu tan hết, chuyển dung dịch này sang bình định mức 50ml và để lắng 1 giờ trong nước đá.
Thêm dần 15 ml Kali Pemanganat 6% vào bình, vừa cho vừa lắc nhẹ, sau đó để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng. Định mức bằng Acid Clohydric 1M đến thể tích 5ml (V). Bình đựng mẫu phân tích phải được đậy kín bằng nút nhựa PE. Mẫu ở trạng thái này có thể bảo quản 1 ngày mà không mất thủy ngân.
- Pha dãy chuẩn
Đồng thời với việc chuẩn bị mẫu phân tích phải chuẩn bị thêm mẫu trắng để so sánh. Mẫu trắng được chuẩn bị mẫu phân tích nhưng không có mẫu phân tích.
- Các điều kiện thực nghiệm
o Vạch phổ đo máy thủy ngân 273,7 nm o Khe đo máy ASS : 0,5 nm
o Cường độ đèn catot rỗng: dùng 80% giá trị cực đại o Thời gian đo : 5 – 10 giây
o Các điều kiện khác chọn phù hợp với máy ASS - Tiến hành thử
o Đặt các điều kiện cho máy để đo thủy ngân o Lắp hệ thống nguyên tử hóa lạnh vào máy o Cho máy chạy không cho ổn định 15 phút
o Đưa mẫu vào và đo quang phổ hấp phụ của thủy ngân lần lượt từ mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu phân tích. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả là trung bình cộng của 3 lần thử đồng thời có sai lệch giá trị không vượt quá 15%. Giới hạn phát hiện của phép đo thủy ngân ở đây là 0,01 /ml
o Hiệu chỉnh giá trị của mẫu trắng (nếu có)
o Dựng đường chuẩn theo hệ tọa độ D – C, trong đó D là cường độ của vạch hấp thụ của thủy ngân trong các mẫu chuẩn tương ứng với các nồng độ Cx của nó trong dãy chuẩn.
o Xác định nồng độ Cx của thủy ngân theo đường chuẩn trên - Tính kết quả
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 31
Hàm lượng của thủy ngân trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau C0 = (Cx . V. F) /a tính bằng /g
Trong đó a là gam mẫu thịt cân để xử lý và định mức thành thể tích Vml. (như trên V = 20ml) , F là hệ số pha loãng mẫu khi đo. Nếu không pha loãng thì F =1 Chú ý: nếu với lượng mẫu như trên ở giá trị Cx nhỏ hơn giới hạn phát hiện của phép đo thì có thể tăng giá trị a lên từ 2 – 3 lần nhưng lượng thuốc thử chỉ cần tăng 70 – 80 lần là đủ chứ không phải tăng như lượng mẫu vì như vậy sẽ quá dư.
2.1.3.6. Xác định Clotridium - Quy trình phân tích
Mẫu được rã đông ở nhiệt độ không quá 450C và được phân tích ngay sau khi rã đông. Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225 ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tủy mật độ hiện diện của Clotridium trong mẫu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt độ 70 – 800C trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác.
Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dung dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa peptri vô trùng. Đổ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 450C vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12 ml ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm 450 vào ống, trộn đều mẫu. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt 2 – 3 ml ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy được ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clotridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song 370C và 500C. Thông thường đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm.
- Báo cáo kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clotridium trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhân với hệ số pha loãng và được trình bày ở dạng CFU/g hay CFU /ml sản phẩm
2.1.3.7. Xác định Bacillus cereus
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 32
2.1.3.8. Định tính Salmonella - Chuẩn bị mẫu phân tích
Chọn những khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính
Cấy ria từ những ống dương tính lên môi trường MYP 10-2, 10-3
Cấy sang thạch nghiêng Nutreient Agar, ủ 300C, 24 giờ
Dương tính: xuất hiện sinh khối => tra bảng MPN
Sử dụng các độ pha loãng 10-1 , 10-2, 10-3 cho loạt MPN 3 ống nghiệm . Ủ trong canh TSP , ủ 300C, 48 ± 2 giờ
Pha loãng đến các độ pha loãng 10-2, 10-3
Gram Pheno
red glucos e 24h 350C kỵ khí
Nitrat broth 350C 24h
Vp, 48
±2h, 350C
Tyros – ine agar, 48h 350C
Lysoz –yme broth 350C 24h
MYP agar 24 – 48h 300C
Phân biệt với các Bacill us nhóm 1
Kết luận: B. cereus
SVTH: TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG TRANG 33
o Dùng kéo cắt nhỏ thịt và cân 25g mẫu thịt cho vào bao PE vô trùng trong điều kiện vô trùng, sau đó cho thêm 225ml dung dịch pha loãng mẫu (BPW – Buffer Pepton Water)
o Tiến hành đồng nhất mẫu bằng tay, sau đó dùng dung dịch pha loãng là 10-1 - Tiền tăng sinh
Đem mẫu chuẩn bị ở trên ủ 370C/ 24h - Tăng sinh chọn lọc
Sau 24h hút 0,1ml mẫu cho vào môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 420C/24h
- Phân lập
o Dùng que cấy vòng lấy 1 vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường RV cấy ria lên môi trường XLD (màu vàng). Sau đó đem ủ ở 370C/24h
o Sau 24h các khuẩn lạc: có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm màu đen, một số có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường XLD chuyển sang màu hồng nghi ngờ là Salmonella
Hình 2.1: Khuẩn lạc Salmonella trên môi truờng XLD - Khẳng định
o Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella được test sinh hóa o Các thử nghiệm sinh hóa: