Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại đắt tiền.
Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2
Hình 1.9 Công thức cấu tạo của chitosan
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50%
gọi là chitin [1]
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy--D- glucosamine liên kết với nhau bàng liên kết -(l-4) glucozit.
26
Qua cấu trúc của chitin và chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp [1].
1.2.1.2. Tính chất lý hoá của chitosan
Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 311°C.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch acid hữu cơ loãng như: acid acetic, acid fomic, acid lactic..., tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch acid acetic 1 – 1,5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme). Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. [1]
Khả năng chống oxi hóa của chitosan
Theo Ming-Tsung Yen và cộng sự (2008) chitosan có khả năng chống oxy hóa tốt, khả năng lọc các gốc hydroxyl và khả năng tạo phức với ion Fe và có thể sử dụng như là một chất chống oxy hóa
Cơ chế kháng khuẩn
Cơ chế chính xác của hoạt động kháng vi sinh vật của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế được quan tâm:[23]
27
Cơ chế thứ nhất
Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lổ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài giúp tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon, 1999).
Khả năng kháng khuẩn của chitosan đối với vi khuân Gram âm mạnh hơn so với vi khuẩn Gram dương (Chung và cộng sự, 2004; No và cộng sự, 2002). Trong khi đó vi khuẩn Gram dương lại nhạy cảm hơn, có thể do vi khuẩn Gram âm có lớp màng chắn.
Cơ chế thứ hai
Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sử hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật,…(Sudarshan và cộng sự, 1992)
Các cơ chế khác
Chitosan kích hoạt một số hàng rào phòng thủ trên tế bào chỉ, chitosan tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, ò-l,3-glucanse, từ đú tiờu diệt vi sinh vật. Cơ chế này khụng cũn đỳng trong trường hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật. Chitosan hoạt động như một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim loại dạng vết do đó ức chế sản xuất chất độc và tăng trưởng vi sinh vật (Cuero, Osuji và Washington, 1991)
28
1.2.1.3. Nguồn cung cấp và phương pháp sản xuất chitosan
Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin. Chitin có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ tôm, cua, côn trùng có bộ cánh cứng, các loài giáp xác, nhuyễn thể (sò, ốc...), từ nấm...Đặc biệt trong vỏ tôm cua, hàm lượng chitin cao, từ 10-15% nguyên liệu khô. Trong đó chitin liên kết với protein, các chất vô cơ mà chủ yếu là CaC03 và các chất béo. Do đó cần phải loại các hợp chất này ra khỏi chitin.
Có 2 phương pháp để sản xuất chitosan là sử dụng hóa chất và enzym. Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng không tốt đến môi trường xung quanh. Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym không làm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao.
Hiện nay trên thế giới, chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùng enzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước.Theo thực tế nghiên cứu điều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế chitin- chitosan theo phương pháp sinh học, do các lý do sau:
+ Hiệu suất thu sản phẩm chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính enzym cao nhung chỉ có một phần nhỏ chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ có những nhóm acetyl của chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với enzym.
+ Việc sản xuất chitosan bằng enzym sẽ thành công khi và chỉ khi enzym được phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa. Mà thực tế, vấn đề các phòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máy móc.
+ Điều chế chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng enzym đòi hỏi phải có một nguồn cung cấp enzym thường xuyên và ổn định hay một môi trường nuôi cấy enzym thích hợp. Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được.
29
Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học lại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn:
+ Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền.
+ Hoá chất sử dụng rẻ tiền.
+ Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao hơn.
+ Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao.
Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm:
+ Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường.
+ Vấn đề thu hồi hoá chất.
+ Điều kiện làm việc với hóa chất ( NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức -NH2.
+ Chưa có biện pháp tận thu protein sau khi loại ra khỏi vỏ giáp xác Bảng 1.8 Thành phần hóa học của vỏ các loại giáp xác
Nguồn Chitin Protein Chitin Ash Lipid
Cua: Collinectes sapidus Chinoecetes opilio
25,1 29,2
13,5 26,6
58,6 40,6
2,1 1,3 Tôm: Pandalus borealis
Crangon crangon Penaeus monodon
41,9 40,6 47,4
17,0 17,8 40,4
34,2 27,5 23,0
5,2 9,9 1,3 Tôm sông: Procamborus clarkii 29,8 13,2 46,6 5,6 Nhuyễn thể: Euphausia superba 41,6 24,0 23,0 11,6
Tôm thẻ 61,6 33,0 29,4 1,4
Chi tiết theo: Muzzarelli (1997), Naczk và cộng sự (1981), Shahidi và Synowiecki (1991) Synowiecki và Al-Khateeb (2000)
30
Hình 1.9: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chitosan Vỏ giáp xác
Rửa và sấy
Rửa, sấy Rửa Khử khoáng
Rửa Loại protein Nghiền và lọc
Deacetyl hóa Rửa, sấy Khử màu
Chitosan
Dd NaOH 3,5% trong 2h ở 65oC
Dd HCl 1N trong 30’, tophòng
Chiết bằng acetone và tẩy trắng bằng NaOCl 0,315% trong 5’, tophòng
Dd NaOH 50% trong 30’ ở 121oC
31
Thuyết minh quy trình:
Vỏ giáp xác thường được nghiền và xử lý bằng dung dịch NaOH 1- 10% ở nhiệt độ cao 65-100°C để hòa tan protein. Thời gian tiến hành phản ứng thường từ 0,5 -12h tùy từng phương pháp sử dụng. Xử lý bằng kiềm kéo dài trong điều kiện nghiêm ngặt để tiến hành quá trình khử protein và deacetyl. Điều kiện tối ưu của quá trình khử protein là sử dụng dung dịch NaOH 3,5% trong 2h ở 65°C, trong điều kiện luôn khuấy và tỉ lệ rắn lỏng là l:10(w/v).
Sau đó rửa và tiến hành khử khoáng bằng dung dịch acid HCl (trên 10%) ở nhiệt độ phòng để hòa tan CaCO3 thành CaCl2. Có thể dùng HC1 nồng độ cao hoặc acid formic 90% để khử khoáng
CaCO3 + 2HC1 CaCl2 + CO2 + H2O
Dùng acid hoặc kiềm để khử màu chitin. Chitin thương phẩm cần phải khử màu hoặc tẩy trắng thành dạng bột trắng. Chất màu trong vỏ giáp xác hình thành phức với chitin. Những nghiên cứu cho rằng đồng phân 4-ceton, 4,4’ dicetone--carotene liên kết chặt chẽ với chitin ở ngoài vỏ của cua. Và mức độ liên kết này thay đổi giữa các loài.
Deacetyl là quá trình chuyển chitin thành chitosan bằng cách khử nhóm acetyl. Đuợc tiến hành bằng xử lý KOH hoặc NaOH 40-50% ở 100°C hoặc cao hơn trong 30’
hoặc lâu hơn nữa để khử 1 phần hoặc hoàn toàn nhóm acetyl khỏi polymer đó. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng chitosan thành phẩm do đó phải đảm bảo điều kiện phù hợp nhất
Cụ thể người ta tiến hành lần lượt các công đoạn sau:
Chuẩn bị:
Rửa và sấy vỏ giáp xác: Phế liệu vỏ giáp xác được thu thập và đun sôi trong lh để loại hết các mô. Vỏtiếp tục được cho vào lò ở 163°Ctrong lh, sau đó lấy ra, tách phần mô đã sấy khô còn sót lại trên vỏ, cọ rửa sạch lớp vỏ.
32
Khử màu: Lớp vỏ cứng bên ngoài của loài giáp xác có chứa chất màu chủ yếu là cardenoid. Thành phần chính là astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin và - carotene. Chúng không xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơ cũng như protein, vì vậy khử protein và khử khoáng cũng không loại được cardenoid. Tuy vậy có thể khử màu bằng chất trích màu như KMnO4, NaOCl, SO2, NaHSO3... Có thể bổ sung công đoạn ngâm vỏ trong dung dịch chất tẩy trắng loãng trước khi thực hiện quá trình đun sôi.
Nghiền và lọc: vỏ sau khi đã làm sạch được đặt trong lò ở 80°C trong 48h để phá vỡ cấu trúc tinh thể của chitin, nhằm chuyển hầu hết chitin trong vỏ thành dạng vô định hình. Sau 48h, vỏ được lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa nitơ lỏng (-196°C) để làm nguội. Việc làm nguội nhanh sẽ hạn chế được sự tái hình thành tinh thể chitin, làm chúng trở nên vô định hình hơn. Ngoài ra trong quá trình làm nguội, nhiệt độ của nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẽ dễ dàng hơn. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra khỏi dung dịch nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày. Có thể thay dung dịch nitơ lỏng bằng hỗn hợp methanol- nước đá khô.
Loại Protein:
Protein được loại bằng cách nấu với NaOH 3,5%, nhiệt độ 60-100°C. Gần đây các nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân như NaOH, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO4, NaHSO3, Ca(SO4)2, NaPO4, Na2S. Song NaOH vẫn được dùng thông dụng hơn.
Tùy từng loại vỏ mà điều kiện xử lý có thể thay đổi về nồng độ NaOH, nhiệt độ hoặc thời gian. Với những loại vật liệu dễ khử protein, có thể dùng Na2CO3 0,1M ở khoảng 100°C trong 4h. Đối với vật liệu khó xử lý, có thể dùng NaOH 5M ở khoảng 100°C trong 4h. Tuy nhiên, hầu hết các quá trình khử thường dùng NaOH 1N với một khoảng nhiệt độ và thời gian xử lý (từ 65-100°C) trong vòng 0,5-7h.
33
Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dung dịch NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10 w/v) ở 65°C. Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90°C. Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm.
Khử khoáng:
Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl,HNO3, H2SO4, CH3COOH, HCOOH..., song người ta thường dùng HC1 ở nhiệt độ phòng. Tùy tính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết. Ngoài ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm. Nguyên liệu được xử lý bằng EDTA ở pH 9 hoặc pH 10, sau đó xử lý ở pH 3 sẽ cho sản phẩm có khoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat.
Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15 w/v) ở 25°C trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau 2h lấy phần vỏ nổi lên trên, rửa bằng nước cất, sấy ở 90°C. Vỏ tôm sau khi đã sấy khô chứa chủ yếu là chitin.
Phán ứng deacetyl hóa:
Phản ứng chính trong điều chế chitosan là deacetyl hóa bằng dung dịch kiềm. Dung dịch phản ứng cần được gia nhiệt và khuấy trộn đều trong suốt thời gian phản ứng.
Tiến hành: Chitin thu được đem phản ứng với dung dịch NaOH 50% (tỉ lệ 1:25 w/v) để trong lò ở 80°C trong 96h.Trung hòa đến pH 7,0 với dd HCl 1N. Chitosan sẽ kết tủa, ta tiến hành lọc hoặc ly tâm, sau đó sấy thu được chitosan.
Tinh sạch chitosan:
Kết tủa sau khi đã sấy khô được nghiền thành bột và hòa tan trong dung dịch acid acetic 2% với tỉ lệ 1:100 (w/v). Cho dung dịch vào các ống thẩm tích, đặt các ống vào dung dịch acid acetic có nồng độ tương đương trong 24h. Mục đích của quá trình nhằm loại bỏ các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ( muối CH3COONa, muối canxi, các protein có phân tử lượng thấp...). Sau đó lấy dung dịch trong ống ra và sấy chân không, ta thu được chitosan gần như tinh khiết (Được kiểm nghiệm bằng phương pháp phân tích HPLC).
34