3.2 Kết quả khảo sát các phương pháp lên men
3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SHF
Hình 3.8. Khảo sát lượng đường khử theo nhiệt độ
Khảo sát ở mốc thời gian tối ưu là 20 giờ thấy rằng hàm lượng glucose và cellulose trong dịch mẫu đạt thấp nhất ở nhiệt độ 37oC (4,1 mg/ml và 28,3 mg/ml).
5.12 3.87 4.88
30.11
28.19 30.01
0 5 10 15 20 25 30 35 40
35oC 37oC 39oC
mg/ml
Nhiệt độ
Glucose Cellulose
53
Lượng cellulose và glucose đạt cao nhất (30,03mg/ml và 4,9mg/ml) ở nhiệt độ 35OC.
Vậy nên có thể kết luận ở nhiệt độ 37oC thì quá trình lên men diễn ra là tốt nhất và lượng đường khử được sử dụng là nhiều hơn cả.
Hình 3.9. khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nhiệt độ
Ở thời điểm khảo sát 20 giờ thấy rằng ở 37oC đạt độ cồn cao nhất là 4,8% và thấp nhất là 4,5% ở 35oC. Nhiệt độ hoạt động tối ưu theo tài liệu vi sinh đại cương của thầy Nguyễn Lân Dũng (2006) nằm trong khoảng 35 – 40oC tuy nhiên trong thí nghiệm này còn khảo sát đến cả yếu tố khác là đường khử và độ Brix. Vậy nên chọn nghiệm thức lên men ở nhiệt độ 37oC là hợp lý nhất.
3.2.3 Kết quả khảo sát pH quá trình lên men SHF:
Độ pH hay nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu các chất dinh dưỡng, sản phẩm lên men qua thành tế bào của nấm men, hoạt động của enzyme. Do đó, pH của môi trường lên men sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả lên men.
4.6 4.8 4.8
8 7.8 7.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
35oC 37oC 39oC
(%)
Nhiệt độ
Độ cồn Độ Brix
54
Hình 3.10. Khảo sát lượng đường khử theo pH
Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC , lượng glucose ở mức cao nhất (6,8mg/ml) ở mức pH khảo sát là 4,5 và cellulose đạt cao nhất (33,7mg/ml) ở pH 5,5.Điều này thấy rằng ở 2 mức pH 4,5 và 5,5 lượng đường khử vẫn còn cao và có thể suy ra rằng hiệu suất của quá trình lên men là chưa đạt tối ưu. Vậy nên thực hiện quá trình lên men ở pH 5 là hiệu quả hơn cả mặc dù lượng glucose trong dịch lên men tuy không thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại nhưng lượng cellulose còn lại có sự giảm xuống đáng kể (29,19mg/ml)
Hình 3.11.Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo pH
7.82
4.87 5.11
29.11
27.19
33.41
0 5 10 15 20 25 30 35 40
pH4,5 pH5 pH 5,5
mg/ml
pH
Glucose Cellulose
4
4.8
3.8
8 7.8
9.2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH 4,5 pH 5 pH 5,5
(%)
pH
Độ cồn Độ Brix
55
Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC ở khoảng pH 5 cho độ cồn cao nhất (4,8%) và chênh lệch khá lớn so với khoảng pH 4,5 và 5,5.
Càng cách xa pH 4,5 và 5,5 nấm men càng hoạt động yếu dần nên độ cồn càng thấp và hàm lượng cellulose còn càng cao. Vậy nên ta chọn nghiệm thức này để tiến hành những thí nghiệm về sau.
3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng dịch nấm men SHF:
Hình 3.12. Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nồng độ nấm men Có thể thấy ở nồng độ 5% giống đạt độ cồn cao nhất là 4,8% cao hơn so với tỉ lệ giống 2,5% nhưng khi tăng tỉ lệ giống lên 7,5% thì độ cồn cũng có tăng lên nhưng độ cồn không thay đổi nữa vì nấm men đã bị nồng độ cồn cao ức. Vậy nên chọn hàm lượng nấm men 5% là tốt nhất.
4.4 4.8 4.9
8.8
7.8
7.2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2,5% 5% 7,5%
(%)
Hàm lượng dịch nấm men (%)
Độ cồn Độ Brix
56
Hình 3.13. Khảo sát lượng đường khử theo nồng độ nấm men
Ở nghiệm thức 2,5% tỉ lệ giống có mức cellulose và glucose là cao nhất (35,12 mg/ml và 7,8 mg/ml) cho thấy quá trình lên men vẫn còn ở hiệu suất thấp.
Ở nghiệm thức còn lại sau khi đã bổ sung nấm men lên thành 5% và 7,5% thấy cả 2 loại đường đều có xu hướng giảm (22mg/ml cellulose và 3,8 mg/ml glucose) ở mức tỉ lệ giống là 7,5%. Có thể khẳng định mật độ nấm men cũng có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, bằng chứng là khi bổ sung nấm men thì thấy lượng đường khử dã giảm xuống. Tuy nhiên ta nên chọn nghiệm thức có tỉ lệ giống là 5% để đảm bảo tính kinh tế khi thực hiện cũng như lượng đường khử còn lại trong dịch cũng không có sự chênh lệch mang tính ý nghĩa so với mức 7,5% .
3.3.1 Kết quả khảo sát thời gian lên men SSF:
7.82
4.87 4.38
35.13
28.19 27.93
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
2,5% 5% 7,5%
(mg/ml)
Hàm lượng dịch nấm men (%)
Glucose Cellulose
57
Hình 3.14. Sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo thời gian lên men SSF
Trước khi lên men , trong dịch không có lượng cồn nào được sinh ra và độ Brix đạt gần như là cao nhất (9,7%).Sau 12 giờ bắt đầu quá trình lên men, lượng cồn bắt đầu tăng với tốc độ khá nhanh và đạt 2,5% ở thời gian 12 giờ. Bên cạnh đó Độ Brix cũng bắt đầu giảm mạnh từ 10,1% xuống còn 8,3% trong 6 giờ. Có thể nói quá trình lên men lúc này đã bắt đầu diễn ra dù chưa đạt đến đỉnh điểm.
Kể từ 12 giờ đến 40 giờ, lượng cồn trong dung dịchdù ko đạt được tốc độ tăng cao như 12 giờ đầu nhưng vẫn tăng lên rất đều đặn và đã đạt được độ cồn cao nhất là 5,1% sau 38 giờ lên men. Trong khoảng thời gian này, nồng độ cơ chất hòa tan trong dung dịch có xu hướng duy trì ổn định và có dấu hiệu đi xuống.
Kể từ 38 giờ , độ cồn duy tiếp tục duy trì như vậy trong những giờ tiếp theo và giảm dần còn 3,4% ở 48 giờ. Độ Brix cũng bắt đầu giảm với tốc độ nhanh hơn so với khoảng thời gian đầu. Và đây cũng là giai đoạn đánh dấu quá trình lên men bắt đầu đi vào pha “suy vong”.
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Thời gian ( giờ)
Độ Brix (%) Độ cồn (%)
58
Hình 3.15. Sự thay đổi lượng đường theo thời gian lên men SSF
Trước quá trình lên men, lượng đường khử đạt mức cao nhất (31 mg/ml cellulose và 10,2 mg/ml glucose) và sau quá trình lên men trong 48 giờ chỉ còn lại 11,2 mg/ml cellulose và 0,31 mg/ml glucose. Điều này cho thấy quá trình lên men đạt hiệu suất khá cao và lượng glucose tiến rất sát về 0. Quan sát vào biểu đồ thấy rằng trong quá trình lên men trong 14 giờ đầu lượng đường khử hầu như là không thay đổi nhiều so với trước lên men dù có giảm xuống . Không những vậy còn thấy có những khoảng thời gian lượng đường có sự tăng lên do quá trình thủy phân lúc này vẫn còn đang diễn ra mạnh và quá trình lên men được xem là chưa thực sự diễn ra.
Kể từ sau 20 giờ, lượng đường trong dịch lên men bắt đầu giảm xuống rõ rệt, lượng cellulose( từ 33,5 mg/ml giảm còn 14,7 mg/ml) trong 14 giờ và glucose ( 4,8 mg/ml giảm còn 0,31 mg/ml) ở mốc thời gian 48 giờ. Đây là mốc thời gian qua trọng đánh dấu quá trình lên men đã thực sự bắt đầu.
Trong khoảng 10 giờ đầu của quá trình lên men đồng thời, mật độ tế bào nấm men tăng mạnh đây là giai đoạn tế bào nấm men thích nghi và bắt đầu sử dụng được chất dinh dưỡng trong môi trường để tăng sinh khối. Ở giai đoạn này , độ cồn thu được
0 5 10 15 20 25 30 35
0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 26h 28h 30h 32h 34h 36h 38h 40h 42h 44h 46h 48h
(mg/ml)
Thời gian (giờ)
Glucose Cellulose
59
cũng tăng mạnh (1,8% lên 2,5% chỉ trong 2 giờ), tuy nhiên lượng cồn thu được vẫn chưa phải là cao nhất. Tương tự độ Brix cũng tăng dần ở khoảng thời gian 6 giờ là 10,1%. Bên cạnh đó có thể thấy lượng glucose sinh ra có xui hướng tăng dần là nồng độ cellulose giảm dần. Có thể nói rằng quá trình lên men lúc này chưa thực sự bắt đầu do tốc độ lên men của nấm men trong giai đoạn này còn yếu do tăng sinh chưa đủ .
Theo khảo sát, khoảng thời gian sau 22 giờ là thời điểm nấm men bắt đầu hoạt động mạnh, cụ thể là độ cồn tăng nhanh đạt cao nhất là 5,1% ở mốc 38 giờ (mỗi 2 giờ tăng khoảng 0,2%). Song song đó nồng độ glucose và cellulose cũng giảm dần và độ Brix cũng giảm mạnh (giảm 3% trong 12 giờ). Mật độ tế bào nấm men lúc này là khá ổn định tuy nhiên cũng bắt đầu giảm dần.Vậy nên đây chính là thời điểm đánh dấu quá trình lên men đã thực sự bắt đầu.
Bắt đầu từ 38 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm dần và bước vào giai đoạn suy vong. Độ cồn bắt đầu giảm xuống còn 3,6% ở 48 giờ có thê do cồn đã khuếch tán ra ngoài môi trường, độ Brix dao động trong khoảng 6,8 – 7,6 và có xu hướng giảm dần.
Lúc này lượng glucose và cellulose cũng giảm xuống. Chất dinh dưỡng trong môi trường lúc này đã gần như không còn đảm bảo cho quá trình lên men cũng như sự tích lũy các chất gây ức chế như CO2, acid, aldehyde... Và lượng glucose trong quá trình thủy phân để sau đó lên men được sử dụng triệt để hơn so với lên men SHF (lượng glucose tiến về 0 gần hơn).Như vậy thời gian tối ưu để lên men SSF là 38 giờ, đạt độ cồn là 5,1%.
Nếu so sánh với thời gian lên men SHF thì thời gian để lên men SSF đạt độ cồn cao nhất sẽ mất nhiều thời gian hơn mặc dù lượng cồn cao nhất thu được nhỉnh hơn dù không đáng kể.
60
3.3.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF:
Hình 3.16. Sư thay đổi độ cồn và độ brix theo nhiệt độ lên men SSF
Kết quả cho thấy ở 37oC thu được độ cồn cao nhất nhưng độ cồn cũng chênh lệch không nhiều và tạo ra lượng ethanol cũng gần như nhau. Tuy nhiên xét thêm độ Brix cũng như lượng glucose tạo thành có xu hướng tăng dần thì ta nên chọn nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men SSF là 37oC.
3.3.3. Khảo sát pH lên men SSF:
Hình 3.17. Sự thay đổi độ cồn và độ brix theo pH trong lên men SSF
Khảo sát ở 3 mức pH, nhiệt độ 37oC, tỉ lệ nấm men 5%, cellulose 5%, đo ở 38 giờ cho thấy ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời. pH từ
4.8 5.1
4.4
8 8
9.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
35oC 37oC 39oC
(%)
Nhiệt độ
Độ cồn Độ Brix
4.7 5.1 4.8
9.1
8
8.8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH4,5 pH5 ph5,5
(%)
pH
Độ cồn Độ brix
61
4,5 đến 5 đạt độ cồn cực đại là 5,1% nhưng tăng lên pH 5,5 thì độ cồn lại giảm xuống chỉ còn 4,5%. Bên cạnh đó pH 5 theo ta biết cũng là pH tối ưu cho cellulase hoạt động trong quá trình thủy phân. Vậy nên khẳng định pH 5 là tối ưu để thực hiện quá trình lên men SSF.
3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme
Độ hấp thụ OD của dd có phản ứng enzyme sau thủy phân
Nồng độ enzyme 3% 5% 7%
OD 540nm 0,869 0,851 0,906
Áp dụng vào công thức tính toán , ta xác định được hoạt tính CMCase của enzyme này là 38,15(IU/g)
62
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
4.1.1 Quá trình tiền xử lý
Từ các khảo sát về các phương pháp tiền xử lý nguyên liệu trước đã rút ra điểm tối ưu cho quá trình tiền xử lý vỏ chuối khô:
- Nồng độ H2SO4 : 2%
- Thời gian ngâm: 2 ngày
- Tỉ lệ Acid : nguyên liệu = 10:1 - Nhiệt độ phòng
4.1.2 Quá trình thủy phân Kết quả rút ra từ khảo sát:
- Nồng độ enzyme cellulose : 5%
- Thời gian thủy phân : 1 ngày - Nhiệt độ : 50oC
- pH 5.0
4.1.3 Quá trình lên men SHF - Thời gian lên men : 20 giờ - Nhiệt độ : 37oC
- pH 5.0
- Tỉ lệ giống : 5%
4.1.4 Quá trình lên men SSF
- nồng độ enzyme cellulose : 5%
- Thời gian : 38 giờ - Nhiệt độ 37oC - pH 5.0
- Tỉ lệ giống : 5%
63
4.2 Kiến nghị
Từ những số liệu rút ra từ bài khảo sát đã cho thấy phần nào khả năng thực hiện quá trình lên men SHF và SSF cũng như so sánh về khả năng tạo ethanol từ vỏ chuối khô của 2 quá trình này. Tuy nhiên, vì không có điều kiện để nghiên cứu sâu hơn nên vẫn còn hạn chế nhiều mặt. Một vấn đề còn rất hạn chế chính là lượng cellulose vẫn còn khá nhiều kể cả sau khi lên men khiến cho khả năng lên men chưa thực sự đạt được như mong muốn. Vì vậy cần nghiên cứu để sử dụng triệt để lượng đường 5C này trong các giai đoạn tiền xử lý và thủy phân là cần thiết.
Chi phí tinh chế ethanol sau khi lên men cũng là một vấn đề khó khăn, gây tốn kém về mặt năng lượng, dù đã thành công trong việc sản xuất xăng sinh học từ phế phẩm nông nghiệp, nhưng để thương mại hóa sản phẩm, cần nên tiếp tục nỗ lực nghiên cứu nhằm hạ giá thành sản phẩm.