2.1.1. Giống dƣa hấu
Các thí nghiệm được tiến hành trên giống dưa hấu lưỡng bội F1 Hắc Mỹ Nhân (Syngenta, Thái Lan). Đây là con lai F1 có thể sinh trưởng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho năng suất cao và tính chống chịu tốt.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị: Nồi khử trùng ALP, tủ ấm Memmert, tủ sấy Memmert, máy cất nước 2 lần Aquatron, cân kỹ thuật Satorius, cân phân tích Pressica XT 220A, máy đo pH Navi, tủ lạnh LG, tủ cấy vô trùng
- Dụng cụ thủy tinh: Đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm - Các dụng cụ khác: Dao cắt mẫu, kéo, panh, kẹp, khay đựng 2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất trong thành phần môi trường cơ bản MS (Muashige Skoog, 1962) (ghi ở phần phụ lục), và các chất kích thích sinh trưởng như BAP, NAA, IBA, KIN và các hỗn hợp hữu cơ khác.
2.2 Phương pháp
2.2.1. Phương pháp vô trùng mẫu
Để khảo sát phương pháp khử trùng mẫu, các hạt giống dưa hấu được chia làm 2 lô: lô hạt để nguyên vỏ và lô hạt đã loại vỏ cứng bên ngoài. Cả 2 lô đều được tiến hành các bước khử trùng như nhau: rửa trước trong cồn 70oC khoảng 5 phút, sau đó hạt được ngâm 5 phút và 10 phút trong dung dịch HgCl2 hoặc dung dịch NaOCl theo các nồng độ như sau:
Dung dịch HgCl2 ở các nồng độ: 0,025; 0,05; 0,075 và 0,1%
Dung dịch NaOCl ở các nồng độ: 0,25; 0,50, 0,75 và 1,0%
Sau khi ngâm trong dung dịch HgCl2 hoặc dung dịch NaClO, các hạt dưa hấu được rửa từ 3 - 5 lần trong nước cất vô trùng (mỗi lần khoảng 10 phút) nhằm loại bỏ
18
hết lượng hóa chất vô trùng còn sót lại trên các hạt trước khi được gieo vào môi trường MS.
2.2.2. Phương pháp tạo mô sẹo
Các hạt dưa hấu vô trùng nảy mầm trên môi trường MS được sử dụng làm nguồn mẫu cho các thí nghiệm tạo mô sẹo. Trước tiên, các mảnh lá mầm được tách rời khỏi trụ lá mầm, sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm. Đối với các lá mầm có kích thước nhỏ tương đương kích thước nói trên thì để nguyên. Các mảnh lá mầm được cấy lên bề mặt môi trường đối chứng C0 (không có chất điều hòa sinh trưởng) và các môi trường C1, C2, C3, C4 được bổ sung BAP (0,5mg/l) và NAA ở các nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Do ánh sáng thường ức chế khả năng hình thành mô sẹo, do đó quá trình nuôi cấy được thực hiện trong tối. Đánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá mầm dưa hấu trên các môi trường khác nhau được thực hiện sau 3 tuần và 6 tuần nuôi cấy.
2.2.3. Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo
Các mô sẹo hình thành trên các môi trường nuôi cấy sau 6 tuần được cắt thành các khối nhỏ (mỗi khối mô sẹo ban đầu được cắt thành 2-3 phần nhỏ hơn) và cấy vào các môi trường tái sinh nhằm khảo sát khả năng tái sinh chồi. Những môi trường này được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP ở các nồng độ tương ứng là 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0mg/l phối hợp với 0,5mg/l NAA. Khác với nuôi cấy tạo mô sẹo dưa hấu, quá trình nuôi cấy tái sinh được thực hiện khi có ánh sáng.
2.2.4. Phương pháp nhân chồi
Các chồi dưa hấu hình thành trên môi trường tái sinh được sử dụng cho các thí nghiệm nhân chồi in vitro. Các môi trường khảo sát sự nhân chồi B1, B2, B3, B4 được bổ sung BAP ở các nồng độ tương ứng: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Tương tự là các môi trường từ K1, K2, K3, K4 được bổ sung kinetin ở các nồng độ lần lượt: 0,5;
1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Số lượng chồi mới hình thành trên các môi trường này được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.
19
2.2.5. Phương pháp tạo rễ
Tạo rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình hình thành cây hoàn chỉnh để có thể sống và sinh trưởng được ngoài đồng ruộng. Để thử nghiệm khả năng tạo rễ, các môi trường nuôi cấy R0, R1, R2, R3, R4, R5 đều được giảm thành phần khoáng đi 50% nhưng có 0,1 mg/l BAP đồng thời có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin là IBA ở các nồng độ tương ứng: 0,1; 0,25; 0,50 và 1,0 mg/l. Sau 1 và 4 tuần ghi nhận khả năng hình thành rễ của các chồi dưa hấu trên các môi trường tạo rễ khác nhau. Đánh giá tỷ lệ ra rễ của chồi dưa hấu nuôi cấy và số rễ trung bình trên cây để lựa chọn được môi trường tạo rễ phù hợp nhất.
2.2.6. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Pha môi trường nuôi cấy theo các công thức tương ứng với mỗi thí nghiệm và dựa trên môi trường cơ bản MS. Sau khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, đường 30g/l và những thành phần khác, các môi trường nuôi cấy được chuẩn pH ổn định ở mức 5,8 tiếp theo thêm 7g/l agar để làm cho môi trường đông lại ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Dụng cụ tiến hành thí nghiệm và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều được vô trùng bằng nồi hấp ALP ở áp suất khoảng 1,1 atm, nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
2.2.7. Các điều kiện nuôi cấy
Các mẫu nuôi cấy được duy trì trong điều kiện nhân tạo có thể điều chỉnh được các thông số vật lý ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu.
Cường độ chiếu sáng trong phòng nuôi cấy ≈ 2000 Lux, còn nhiệt độ được duy trì ≈ 25oC.
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi tảo và Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung Tâm Khoa học Sự sống và tại Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
20
2.2.8. Xử lý số liệu
Để đánh giá hiệu quả của các thí nghiệm đã tiến hành, chúng tôi dựa vào các tiêu chí sau:
- Đánh giá kết quả khử trùng:
Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100
Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100
- Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = x 100
- Đánh giá kết quả nhân chồi
Hệ số nhân chồi (%) = x 100
- Đánh giá sự hình thành rễ
Tỷ lệ tạo rễ (%) = x 100
- Đánh giá tỷ lệ sống sót khi đưa ra bầu đất
Tỷ lệ sống sót (%) = x 100
21
CHƯƠNG 3