Mô sẹo là khối các tế bào chưa phân hóa về cấu trúc và chức năng, thường được hình thành do tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin. Trong đó 2,4D là auxin được dùng phổ biến cho quá trình hình thành mô sẹo của nhiều loài thực vật.
Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy mô sẹo dưa hấu được hình thành do 2,4D không thể tái sinh thành chồi. Vì vậy, để khảo sát sự hình thành mô sẹo đồng thời có thể thu nhận chồi tái sinh từ mô sẹo, chúng tôi đã sử dụng NAA thay cho 2,4D.
24
Từ các hạt dưa hấu nảy mầm được 1 tuần tuổi, các lá mầm được tách rời ra và cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm và sau đó được cấy vào các môi trường cảm ứng hình thành mô sẹo. Môi trường đối chứng C0 có thành phần như sau:
C0: MS + 30 g/l đường + 50 ml/l nước dừa + 7 g/l agar
Các môi trường thí nghiệm C1, C2, C3, C4 đều có thành phần giống với môi trường đối chứng nhưng có bổ sung thêm phytohormone NAA ở các nồng độ tương ứng: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Các bình nuôi cấy đều được nuôi trong điều kiện không có ánh sáng để kích thích quá trình hình thành mô sẹo. Trong quá trình theo dõi sự hình thành mô sẹo, chúng tôi nhận thấy: khi nuôi cấy được 3-4 ngày, các lá mầm có hiện tượng trương lên. Sau đó khoảng 2 tuần trên các môi trường có bổ sung NAA bắt đầu xuất hiện những hình cầu nhỏ màu trắng ở viền của lá mầm, nơi bị cắt và tiếp xúc với môi trường. Tiếp theo, những lá mầm đó có xu thế hình thành mô sẹo, từ vết cắt lan dần vào trung tâm của mảnh lá mầm. Ở môi trường đối chứng C0, mảnh lá mầm có tăng lên về kích thước nhưng hoàn toàn không hình thành mô sẹo.
Sau 3 tuần nuôi cấy trong tối, các môi trường C1, C2, C3 và C4 đều có hình thành mô sẹo, đã cho thấy NAA là thành phần cần thiết trong kích thích tạo mô sẹo ở mẫu dưa hấu nuôi cấy. Tiếp tục nuôi thêm 3 tuần nữa, mô sẹo có các cấu trúc đồng đều nhất và có màu vàng hình thành trên mảnh lá mầm là ở môi trường C2 (có chứa 1,0 mg/l NAA). Các môi trường C3 (có 1,5 mg/l NAA), C4 (có 2,0 mg/l NAA) cũng có hình thành các khối mô sẹo rõ rệt nhưng chuyển màu sẫm hơn hoặc không phân bố đều xung quanh vết cắt của mảnh lá mầm (hình 3.1). Nhìn chung mô sẹo hình thành trên các môi trường này đều có màu vàng hơi sẫm, với các cấu trúc đặc nhưng khối mô sẹo có kích thước nhỏ cho thấy môi trường kích thích hình thành mô sẹo cần phải bổ sung thêm một hoặc vài thành phần khác để thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo dưa hấu in vitro.
25
Hình 3.1 Kết quả tạo mô sẹo trên môi trường chỉ có NAA (sau 6 tuần nuôi cấy) A: môi trường đối chứng C0; B: môi trường C1; C: môi trường C2; D: môi trường C3; E: môi trường C4.
E
A B
C D
26
Để làm tăng kích thước khối mô sẹo cần thiết cho các thí nghiệm tái sinh chồi sau này, chúng tôi đã thử nghiệm bổ sung thêm cytokinin (0,5 mg/l BAP) vào các môi trường nuôi cấy. Thành phần của các môi trường này (C5, C6, C7, C8) là tương tự như các môi trường C1, C2, C3, C4 nhưng có thêm 0,5 mg/l BAP. Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy trong tối, tất cả các môi trường có bổ sung NAA và BAP đều hình thành mô sẹo. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trường C5, C6, C7, C8 sau 3 tuần nuôi cấy lần lượt là 65; 87,5; 85,0 và 63,63% trong khi môi trường đối chứng không hình thành mô sẹo (hình 2). Sau 6 tuần nuôi cấy, tỷ lệ các mảnh lá mầm tạo mô sẹo ở môi trường C5 là 87,5%, trong khi ở các môi trường C6, C7, C8 tất cả các mảnh lá mầm đều có hình thành mô sẹo. Còn trên môi trường đối chứng, mảnh lá mầm chuyển màu vàng đậm và vẫn không hình thành mô sẹo.
Trên các môi trường C5, C6, C7, C8, khối mô sẹo có kích thước lớn hơn hẳn so với mô sẹo tạo ra trên môi trường chỉ có NAA (môi trường C1, C2, C3, C4) và phát triển bao trùm hoàn toàn mảnh lá mầm. Các khối mô sẹo trên các môi trường đều có màu khá giống nhau từ trắng vàng đến vàng nhạt với các khối cấu trúc tơi xốp, chứng tỏ BAP ở nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với NAA có tác dụng rõ rệt trong hình thành mô sẹo dưa hấu. Môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ phát sinh mô sẹo mà còn ảnh hưởng tới chất lượng mô sẹo, từ đó dẫn tới ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi. Ở môi trường C6 (1,0 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAP) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất là 89,47 và 100% tương ứng với sau 3 và 6 tuần nuôi cấy (bảng 3.3). Đây là các khối mô sẹo được hình thành trực tiếp từ mẫu cấy lá mầm dưa hấu do vậy có thể dùng làm mẫu để nhân sinh khối mô sẹo hoặc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm tái sinh chồi từ mô sẹo.
27
Hình 3.2 Kết quả tạo mô sẹo trên môi trường có NAA và BAP (sau 6 tuần nuôi cấy)
A: môi trường đối chứng C0b; B: môi trường C5; C: môi trường C6; D: môi trường C7; E: môi trường C8.
E
A B
C D
28
Bảng 3.3 Kết quả hình thành mô sẹo dưa hấu trên môi trường có NAA và BAP
MT
Nồng độ NAA (mg/l)
Số mẫu
3 tuần 6 tuần
Tỷ lệ tạo mô sẹo
(%)
Đặc điểm mô sẹo
Tỷ lệ tạo mô sẹo
(%)
Đặc điểm mô sẹo C0b 0 20 0,0 Không tạo mô sẹo 0,0 Không tạo mô sẹo
C5 0,5 20 65,0 Màu trắng sữa, xốp 87,5 Màu trắng vàng, xốp C6 1,0 20 87,5 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp C7 1,5 20 85,0 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp C8 2,0 20 63,63 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp