Liệu pháp điều trị sử dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ là một liệu pháp đầy hứa hẹn trong điều trị nhiều bệnh khó nhờ những ưu điểm lớn như sự có mặt của chúng trong cơ thể trưởng thành tương đối phong phú và dễ tái tạo, việc phân lập và nhân rộng tế bào không mấy khó khăn và không bị hệ miễn dịch đào thải.
Cho tới nay, đã có hàng trăm thử nghiệm lâm sàng sử dụng MSCs đã được đăng ký ở Mỹ tại https://clinicaltrials.gov/ và nhiều nghiên cứu lâm sàng tương tự tại các quốc gia khác. Do lượng tế bào MSCs có sẵn trong cơ thể khá hạn chế và có xu hướng tỷ lệ nghịch với tuổi của bệnh nhân [49] nên để ứng dụng được trên lâm sàng thì các tế bào gốc từ mô mỡ cần được nuôi cấy ngoài cơ thể nhằm thu được một số lượng tế bào đủ lớn cung cấp cho việc ghép. Tuy nhiên, các tế bào gốc sở hữu một số đặc điểm đặc trưng của tế bào ung thư: tuổi thọ dài, có khả năng chống lại apotosis trong chừng mực nhất định, và có khả năng phân chia trong thời gian dài.
Thêm vào đó, các cơ chế điều kiểm soát và các yếu tố điều hòa tăng trưởng đều tương tự nhau ở cả tế bào ung thư và tế bào gốc [51]. Thêm vào đó, trong quá trình nuôi cấy in vitro, tế bào gốc trải qua rất nhiều lần phân chia nên vật chất di truyền dễ bị hư hại dưới ảnh hưởng của các yếu tố nội bào và ngoại bào. Do đó, các bất thường về di truyền có thể được tích lũy và dẫn tới sự biến đổi thành các tế bào ác tính [52]. Vì vậy, khả năng tế bào gốc có thể biến thành ác tính được xem là trở ngại chính trong việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ tế bào gốc vào việc điều trị.
Đặc biệt, đối với bệnh nhân lớn tuổi có vết thương mạn tính - đối tượng có nguy cơ mắc ung thư tăng theo tuổi tác thì tính an toàn của các tế bào ASCs dùng để ghép càng cần được đánh giá kỹ lưỡng. Ngoài ra, huyết thanh bê là thành phần bổ sung được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy có thể là trung gian truyền bệnh cho bệnh nhân và gây ra phản ứng miễn dịch [31]. Trên lâm sàng, ASCs được đưa vào sử dụng có thể là ASCs tự thân hoặc đồng loại nên cần có các tiêu chuẩn cho
quá trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản và sử dụng ASCs trong các ứng dụng lâm sàng và đánh giá an toàn.
Trên thế giới, việc đánh giá các nguy cơ có thể xảy ra khi sử dụng tế bào gốc mỡ đã được nghiên cứu khá đầy đủ qua nhiều tiêu chí ở nhiều thế hệ tế bào sau nuôi cấy tăng sinh [49, 56, 27,], Theo một nghiên cứu của Chua và cộng sự, ASCs sau khi được nuôi cấy tăng sinh tới thế hệ ít hơn P20 (sau khoảng 42 lần phân chia tế bào) thì được đánh giá sự thay đổi về hình thái, mức độ biểu hiện gen ức chế khối u, đột biến p53, hoạt tính telomerase, xác định chiều dài telomere và tiến hành kiểm tra khả năng hình thành khối u trong điều kiện in vivo. Người ta nhận thấy mức độ tổn thương DNA xảy ra từ P15 tới P20, không có sự thay đổi đáng kể trong sự biểu hiện của gen p53 và p21, không có sự thay đổi đánh kể trong nồng độ telomerase và chiều dài telomere ở tất cả các thế hệ tế bào. Tiếp đó, ASCs ở thế hệ P15 và P20 được cấy trên chuột và tác giả không quan sát thấy sự hình thành khối u trong môi trường in vivo sau khi cấy ghép 4 tháng. Những dữ liệu này cho thấy, ASCs sau nuôi cấy tới P20 có rất ít nguy cơ tạo khối u và điều này chỉ ra rằng, mô mỡ là nguồn tế bào gốc an toàn cung cấp cho liệu pháp tế bào [50].
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, việc đánh giá sự an toàn của ASCs sau nuôi cấy tăng sinh thông qua sự đánh giá về mặt hình thái, nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) và định lượng enzyme telomerase của tế bào từ P1 tới P5.
1.7.1. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua nhiễm sắc thể đồ
Nhiễm sắc thể là một cấu trúc nằm trong nhân của tế bào, được cấu tạo bởi sợi nhiễm sắc (chromatin), đó là phức hợp giữa DNA và protein. Trong nhân tế bào, chất nhiễm sắc tồn tại thường xuyên dưới dạng sợi nhiễm sắc mảnh, khó quan sát.
Khi bước vào thời kỳ phân bào, sợi nhiễm sắc bắt đầu đóng xoắn và đạt độ nén cực đại ở kỳ giữa. Lúc này, nhiễm sắc thể (chromosome) dày hơn và đã ở dạng kép gồm hai nhiễm sắc tử (chromatid) đính nhau ở tâm động (centromere), chúng có hình dạng và kích thước đặc trưng nên có thể quan sát và đếm số lượng thông qua kính hiển vi quang học.
Công thức nhiễm sắc thể ở người hay còn gọi là Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) được viết dưới dạng: 46,XX hoặc 46,XY. Bất kỳ một thay đổi nào về
số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể của một tế bào/ quần thể tế bào trong cùng đĩa nuôi cấy so với công thức nhiễm sắc thể chuẩn, đều có thể dẫn đến các bất thường trong quá trình phát triển của tế bào/ quần thể tế bào đó.
Trong lâm sàng, nhiễm sắc thể đồ được ứng dụng rộng rãi trong các chẩn đoán trước sinh, sau sinh để phát hiện ra các bệnh hay dị tật hay hội chứng có liên quan tới những bất thường về nhiễm sắc thể. Ngoài ra, nhiễm sắc thể đồ còn được sử dụng trong phân loại và tiên lượng điều trị một số loại ung thư. Chẳng hạn, sự lặp đoạn của gen NMYC trong nhiễm sắc thể, đặc biệt là mất đoạn nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 và thêm đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số 7 có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị u nguyên bào thần kinh [7] .
Việc đánh giá xu hướng biến đổi thành ác tính của các tế bào gốc trung mô bằng các nghiên cứu di truyền tế bào là việc cần thiết, đặc biệt là nhiễm sắc thể đồ vì việc duy trì một kiểu nhân bình thường là một chỉ số đáng tin cậy về sự ổn định về mặt di truyền của MSCs. Nhiễm sắc thể đồ cần được coi là một tiêu chí đánh giá tế bào trước khi đưa vào sử dụng trong lâm sàng [12].
Kỹ thuật phân tích công thức nhiễm sắc thể là một kỹ thuật di truyền tế bào được sử dụng trong đánh giá sự ổn định bộ gen của các dòng tế bào, đặc biệt các dòng tế bào từ các khối u. Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể thường gặp bao gồm: Kỹ thuật nhuộm băng C, Kỹ thuật nhuộm băng Q, Kỹ thuật nhuộm băng G, Kỹ thuật nhuộm băng R và Kỹ thuật nhuộm băng N. Trong các kỹ thuật lập karyotype, kỹ thuật nhuộm band G cho biết nhiều thông tin nhất về đánh giá di truyền của các dòng tế bào bởi nó cho phép xác định những bất thường cả về mặt số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể [12]. Khi sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G, trên NST hiện lên các dải vạch có độ đậm nhạt khác nhau. Đó là do sự bắt màu khác nhau của vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) và vùng nhiễm sắc thực (euchromatin). Kỹ thuật này, được thực hiện bằng thuốc nhuộm Giemsa sau khi đã xử lý NST bằng trypsin và chọn vào kỳ giữa (metaphase) hoặc kỳ tiền giữa (prometaphase) của nguyên phân.
Ở 2 kỳ này, NST cho hình ảnh rõ nét nhất giúp đánh giá được số lượng và cấu trúc của NST một cách dễ dàng. Đây là phương pháp nhuộm được sử dụng rộng rãi để đánh giá các bất thường của nhiễm sắc thể về số lượng và cấu trúc. Phương pháp này đơn giản, dễ làm, chi phí thấp và được ứng dụng rộng rãi.
Khi ASCs được cấy chuyền nhiều lần có thể gây ra những biến đổi trong cấu trúc vật chất di truyền. Meza-Zepeda và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật nhuộm band G cơ bản và kỹ thuật CGH (comparative genomic hybridization) để phân tích tính ổn định về mặt di truyền ở mức độ dưới khả năng phát hiện của kính hiển vi của ASCs sau khi nuôi cấy tăng sinh qua nhiều thế hệ. Kết quả, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy karyotype của ASCs vẫn giữ được trạng thái bình thường [12]. Một nghiên cứu đánh giá rằng ASCs rất bền vững về mặt di truyền trong điều kiện nuôi cấy, công thức nhiễm sắc thể vẫn duy trì trạng thái bình thường sau 100 lần phân chia. Tuy nhiên, nhiễm sắc thể đồ bất thường của MSCs và ASCs của người sau khi cấy truyền đã được phát hiện trong một số nghiên cứu khác. Chẳng hạn, nhóm nghiên cứu của C. Bellotti đã tìm thấy 1 đột biến chuyển đoạn của 1 trong số 4 người hiến mẫu mỡ ở lần cấy chuyền thứ 7 và một người khác trong số 4 người nói trên có đột biến trisomy trong lần cấy truyền thứ 15 [12].
Công nghệ tế bào gốc gần đây đã và đang được ứng dụng rất nhiều trong y học để điều trị nhiều bệnh như ung thư hay các tổn thương khó lành,... Tuy nhiên, để có thể ứng dụng tế bào gốc qua nuôi cấy vào điều trị bệnh thì các nhà nghiên cứu cần phải chứng minh được rằng tế bào thông qua nuôi cấy phải đảm bảo không bị thay đổi về cấu trúc và chức năng của NST bởi việc xác định kiểu nhân của ASCs sau nuôi cấy là một tiêu chí quan trọng trong đánh giá sự ổn định về mặt di truyền của tế bào ở cấp độ tế bào.
1.7.2. Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định lượng enzyme telomerase
Telomere
Telomere là một phức hệ nằm ở mút nhiễm sắc thể. DNA của telome ở động vật có xương sống là TTAGGG và chiều dài trung bình của telomere khác nhau ở các cá thể người, dao động từ 5 đến 20 kb tùy theo độ tuổi, tùy cơ quan và số lần phân chia của mỗi tế bào. Trong quá trình tổng hợp và phân chia DNA, telomere bị ngắn lại vì một đoạn của telomere không được sao chép bởi enzyme DNA polymerase. Hiện tượng ngắn lại của telomere là một trong các cơ chế phân tử của hiện tượng lão hóa do sự giảm chiều dài trầm trọng của các telomere gây ra sự lão hóa nhiễm sắc thể và khiến cho tế bào bị chết. Nhằm ngăn chặn sự ngắn lại của
telomere gây ra bởi sự phân hủy của các exonuclease, sợi đơn telomere đầu 3’ tự do được cuộn vào vùng D-loop của DNA telomere để tạo ra phức hệ T-loop. Thêm vào đó, T-loop còn được tăng cường độ bền vững với TRF2 và các protein liên kết với DNA của telomere như TRF1, POT1, TIN2, TPP1, RAP1…[11]
Hình 1.6. Cấu trúc vùng T-loop của telomere ((theo Blasco, 2003)
Nhờ sự bảo vệ chặt chẽ của các protein cùng cấu trúc “cài then” mà telomere giúp các nhiễm sắc thể không có “cơ hội” gắn kết với nhau ở đầu tận cùng của chúng. Telomere của các sinh vật nhân chuẩn có các đặc điểm cấu tạo như sau:
- Có các protein đặc trưng liên kết ở phần đuôi của nhiễm sắc thể.
- Phần DNA tận cùng của nhiễm sắc thể ở dạng sợi đơn, mang trình tự lặp, cuộn lại thành dạng kẹp tóc.
Mỗi lần phân bào, một người mất trung bình 30 – 200 cặp base ở các telomere của tế bào đó. Những tế bào bình thường chỉ có thể phân chia khoảng 40 – 70 lần cùng với sự ngắn dần của các telomere cho đến khi lão hóa, chết hoặc duy trì những sai sót di truyền dẫn đến ung thư. Tuy nhiên, có những trường hợp chiều dài của telomere không bị ngắn đi (như ở mô cơ tim) do chúng không liên tục phân chia. Telomere có các chức năng sau:
- Giúp tế bào phân chia mà không làm mất gene. Nếu không có telomere, những gene cấu trúc quy định những tính trạng của cơ thể sẽ bị rút ngắn dần sau mỗi lần phân bào.
- Giữ cho các nhiễm sắc thể không bị dung hợp với nhau hoặc tự dung hợp ở những vị trí tận cùng: Khi cắt bỏ đoạn telomere ở 2 đầu của các nhiễm sắc thể,
người ta phát hiện ra nhiều nhóm nhiễm sắc thể dính nhau ở đầu tận cùng, hoặc tự dính vào nhau ở 2 đầu gây nên sự khép vòng. Chức năng này có được do sự hình thành cấu trúc kẹp tóc trong telomere: phần DNA tận cùng cuộn xắn lại, giúp cho những phần DNA mạch đơn không thể kết cặp bổ sung một cách ngẫu nhiên với nhau.
Telomerase và mối liên quan giữa telomerase với bệnh ung thư
Telomerase là một enzyme phiên mã ngược có chứa một phân tử RNA mẫu cho phép sự sao chép đoạn lặp lại TTAGGG vào đuôi nhiễm sắc thể nhằm duy trì chiều dài của vùng telomere. Nếu không có telomerase, độ dài của telomere sẽ ngắn lại sau mỗi lần tế bào phân chia. Khi telomere ngắn đến một độ nào đó, tế bào sẽ không phân chia nữa và chết theo chương trình.
Tế bào ung thư khác với tế bào bình thường ở hai đặc điểm, đó là sự bất quy tắc và không giới hạn trong phân chia tế bào. Bệnh ung thư phát sinh khi một tế bào tích lũy các đột biến di truyền cùng với việc tế bào đó thoát khỏi sự kiểm soát bình thường trong quá trình phân chia và di cư. Khi các tế bào và các thế hệ tế bào của nó phân chia không có kiểm soát, chúng sẽ xâm nhập và gây hại mô lân cận. Một số tế bào đi vào mạch máu và di cư đến các bộ phận trong cơ thể và tạo ra mô ung thư mới. Telomerase hoạt động trên telomere, có thể góp phần vào sự phát sinh nhiều bệnh ung thư ở người [10].
Lĩnh vực nghiên cứu ung thư bắt đầu quan tâm tới telomerase và chiều dài telomere từ những năm 1990. Các thí nghiệm ban đầu cho thấy các telomere bị ngắn đi ở các nguyên bào sợi khi nuôi cấy nguyên bào sợi qua nhiều thế hệ và telomerase gần như không hoạt động ở những thế hệ nuôi cấy đầu tiên. Trái lại, khi kéo dài số lần cấy truyền trên 20 thế hệ, các tế bào bắt đầu có sự biến đổi về hình thái và phân chia, chiều dài telomere trở nên ổn định và telomerase được hoạt hóa, thể hiện ở sự gia tăng nồng độ. Điều này gợi ý rằng, telomerase có vai trò nhất định đối với sự tăng trưởng của các tế bào bất tử trong nuôi cấy. Một số thí nghiệm khác cũng cho thấy các khối u có telomere ngắn hơn mô bình thường và telomerase được hoạt hóa ở nhiều khối u mà không biểu hiện ở nhiều mẫu mô lành [10].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng telomerase hoạt động mạnh ở tế bào gốc phôi và khoảng 85% tế bào ung thư [11, 12, 31].
Hình 1.7. Chiều dài telomere và hoạt tính của telomerase ở các dòng tế bào ung thư phổi (SCLC: Small Cell Lung Cancer): tế bào ung thư biểu mô tuyến và
tế bào ung thư biểu mô vảy (theo Broccoli, 1995)
Trái lại, nồng độ của nó lại rất thấp hoặc gần như không biểu hiện trong các tế bào soma hay các loại tế bào gốc khác (trong đó có tế bào gốc trung mô). Trên cơ sở này, telomerase đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán, dự đoán và điều trị ung thư. Do đó, việc đánh giá tính an toàn của các tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy thông qua đánh giá hoạt tính của enzyme telomerase một tiêu chí lựa chọn quan trọng và rất cần thiết trước khi cấy ghép chúng vào cơ thể [71].