MỤC TIÊU
Thực hiện được các tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống
Thực hiện được các tiêu bản quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết( nhộm đơn và kép)
Thực hiện được các bước định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp điếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Kỹ thuật chỉnh kính hiển vi khi quan sát trạng thái sống và trạng thái chết
Khi vi sinh vật ở trạng thái sống:
• Lấy một phiến kính sạch cho 1 giọt nước hay 1 giọt phẩm màu methylene blue (0.1%). Sau đó cho vi sinh vật hòa tan trong giọt nước hay giọt màu loãng đó.
• Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu, nghiêng một góc <= 45 độ và hạ lá kính xuống để không có bọt khí.
• Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quang sát ở vật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật rồi
dùng nút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh vi sinh vật. Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật di chuyển phiến kính đến vùng muốn quan sát trong thị trường.
• Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.
Khi vi sinh vật ở trạng thái chết:
• Cố định vi sinh vật bằng cách cho 1 giọt sinh khối vi sinh vật trải đều trên phiến kính sạch, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi khô (không còn ướt, nhưng không được cháy).
• Cho 1 giọt (lớn) phẩm nhuộm đơn (methylene blue 0.1% hoặc Carbofuchsin 0.1%) lên vết vi sinh vật đã cố định để trong 5 phút.
• Rửa nước bằng đầu xịt của bình tia cho đến khi sạch màu và làm khô bằng ngọn lửa đèn cồn (có thể dùng giấy mềm để thấm nhẹ nước, nhưng không dùng giấy mềm để lau).
• Nhỏ 1 giọt dầu cefdre lên vết nhuộm, đưa lên bàn mẫu.
• Nâng tụ quang, mở chắn sáng nhìn từ ngoài, hạ vật kính 100X xuống chìm vào giọt dầu cefdre.
• Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc chỉnh thô từ từ cho đến khi thoáng thấy vật thì điều chỉnh ốc chỉnh tinh để trông rõ vật.
2. Cấu tạo buồng đếm
Buồng đếm làm bằng thủy tinh, ở giữa có hai khu vực nhỏ để đặt mẫu, mỗi khu vực là một hình vuông được rạch bằng tia laze. Trong mỗi hình vuông có một khu trung tâm, trong khu trung tâm có tất cả 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn như vậy lại có 16 ô vuông nhỏ. Diện tích mỗi ô vuông nhỏ là 0.0025mm2. chiều sâu 0.1mm2.
3. Kĩ thuật nhộm Gram
Nhộm Gram là phương pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn Gram dương và gram âm do Han Christian Gram người Đan Mạch lần đầu tiên mô tả vào 1844. Khi cùng nhộm màu tế bào theo cùng một phương pháp, tế bào vi khuẩn Gram dương sẽ giữ màu tím, còn tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng.
II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. Quan sát tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học Bước 1: Kiểm tra kính hiển vi:
- Cắm điện, bật công tắc đèn kiểm tra
- Kiểm tra ốc,vật kính còn tốt, còn sử dụng được không
- Kiểm tra vật kính, lau sạch nếu thấy còn bẩn Bước 2: Đặt tiêu bản đã chuẩn bị trước lên bàn mẫu
- Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật sau cho mẫu vsv phải nằm trong vùng thị trường
- Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sang sao cho nhìn rõ đươc hình ảnh
- Tùy loài vsv mà sử dụng vật kính thích hợp (10X,40X,100X)
- Dùng ốc chỉnh thô, điều chỉnh cho vật mẫu lên sát vật kính cho đến khi thấy được ảnh vsv
- Dùng ốc chỉnh tinh vặn chỉnh để thấy rõ ảnh vsv
- Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính lớn hơn và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh
Bước 3: Sau khi quan sát xong, tắt đèn, hạ bàn mẫu xuống . Lấy tiêu bản ra khỏi bàn mẫu.Vệ sinh các vật kính và bàn mẫu cho sạch
2. Nhộm gram
Bước 1: Cho 1 giọt sinh khối vsv lên phiến kính sạch, hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Không để quá gần ngọn lửa làm cháy vết bôi
Bước 2: Nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh .Nhỏ 2 giọt methyl violet lên vết bôi giữ 30 giây. Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm rồi hơ khô.
Bước 3: Nhuộm vết bôi bằng dung dịch Lugol. Nhỏ 2 giọt I2/KI lên vết bôi, để 1 phút . Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm đến khi mất hết màu và hơ khô.
Bước 4: Nhỏ 2 giọt sarafin lên vết bôi, để yên 30 giây Rửa vết bôi bằng nước, hơ khô , nhỏ 2 giọt dầu soi kính lên vệt bôi. Đưa lên bàn mẫu chỉnh kính hiển vi và quan sát ở vật kính 100X
3. Đếm trực tiếp tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi
Bước 1: Pha loãng mẫu sao cho mỗi ô lớn trong buồng đếm tứ 5 -10 tế bào vi sinh vật
Bước 2: Nhỏ một giọt mẫu lên buồng đếm và đậy lại bắng lá kính
Bước 3: Đưa buồng đếm vào kính hiển vi, quan sát ở vật kính 10X, thấy buồng đếm rồi chuyển sang vật kính 40X.
Bước 4: Tiến hành đếm:Chọn 5 ô lớn, gốm 1 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở giữa.
Các ô chọn phải mang tính đại diện cho cả buồng đếm. Kết quả lấy số trung bình cộng của 5 ô đó.
III. CÂU HỎI ÔN TẬP
1. Nêu kỹ thuật chỉnh kính hiển vi khi quan xác trạng thái sống và chết?
Đặc phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quan sát ở vật kính 10X.
Dùng ốc chỉnh thô nâng lên bàn mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật rồi dùng ốc chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh vi sinh vật.
Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển vật mẫu di chuyển phiến kính đến vùng muốn quan sát.
Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và điều chỉn ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.
2. Nêu kĩ thuật chỉnh kính hiển vi quan sát và đếm tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu?
Đưa buồng đếm vào kính hiển vi, quan sát ở vật kính 10X, thấy buồng đếm rồi chuyển sang vật kính 40X.
Tiến hành đếm:Chọn 5 ô lớn, gốm 1 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở giữa. Các ô chọn phải mang tính đại diện cho cả buồng đếm. Kết quả lấy số trung bình cộng của 5 ô đó.
3. Giải thích tại sao trong quá trình thao tác với VSV, người ta thường dùng cồn 700 để tiệt khuẩn tay và nơi làm việc mà không dùng cồ 900 hay 600?
Vì cồn 900 đậm đặc nên bay hơi nhanh so với cồn 700 . Và cũng chính vì cổn 900 đậm đặc nên sẽ làm thành tế bào vi khuẩn, vi sinh vật đông lại, tạo một lớp màng cứng bảo vệ nên sẽ mất tác dụng. Còn cồn 600 thì hơi loãng nên không hiệu quả. Vì vậy người ta thường dùng cồn 700 để diệt khuẩn tay và nơi làm việc.