Các bước chính trong quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR có thể tóm tắt theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Quy trình thực hiện kỹ thuật QF- PCR
2.2.1. Phương pháp ly trích DNA từ dịch ối bằng kit Instagen Matrix Các bước chính được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất [6].
- Sau khi nhận mẫu dịch ối, ly tâm 1.500 rpm trong 5 phút để kiểm tra chất lượng mẫu. Nếu mẫu lẫn máu nhiều sẽ được chuyển sang bước cấy để nuôi cấy tế bào ối.
- Chuẩn bị các tube 1,5 ml đánh số tương ứng với mã số bệnh nhân.
- Đổ bớt dịch ối đến thể tích 2 ml thì ngừng. Sử dụng micropipette hút 200 l cặn dịch ối sang tube đã chuẩn bị sẵn.
- Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút loại bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 200 l dung dịch PBS. Vortex. Ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
- Tùy theo lượng cặn ối tiến hành bổ sung 100 – 200 l InstaGene Matrix.
- Vortex sau đó tiến hành spin.
- Ủ trong 8 phút ở 99 - 100OC.
Mẫu dịch ối Ly tâm
Ly tâm
Hút bỏ dịch nổi
Hút cặn dịch ối và rửa với dung dịch PBS
Ly tâm
- Vortex ở tốc độ cao. Ly tâm 12.000 rpm trong 2 phút.
Những bước chính trong ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix được tóm tắt theo sơ đồ 2.2.
Bổ sung dung dịch InstaGene Matrix Vortex
Spin -
- - - -
- - - -
- - - -
Vortex
DNA được ly trích Ủ lắc
Sơ đồ 2.2. Quy trình ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix.
20 l
20 l 2.2.2. Quy trình phản ứng luân nhiệt – PCR
Ứng với mỗi mẫu DNA sau khi được ly trích sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ kit Devyser Complete.
Thành phần phản ứng PCR 1 gồm có:
DNA mẫu 5 l
PCR Activator
Devyser Complete Mix 1 Thành phần phản ứng PCR 2 gồm có:
DNA mẫu 5 l
PCR Activator
Devyser Complete Mix 2
Devyser Complete Mix 1 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 14 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21. Tương tự, Devyser Complete Mix 2 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 19 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21, X, Y và đặc biệt trong đó có 2 marker là T1, T3 được sử dụng để đếm số lượng NST X. Các marker được trình bày trong bảng 2.1. và 2.2.
Bảng 2.1. Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 1 [13].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
13A D13S742 13q12.12 222 – 334 Xanh lá
13B D13S634 13q21.32-q21.33 365 – 435 Xanh dương
13C D13S628 13q31.1 420 – 475 Vàng
13D D13S305 13q13.3 435 – 505 Xanh lá
13K D13S1492 13q21.1 100 – 175 Vàng
18B D18S978 18q12.3 195 – 230 Vàng
18C D18S535 18q12.3 300 – 350 Xanh dương
Vật liệu – Phương pháp Thực tập Tốt nghiệp
18-D1 D18q22.1 18q22.1 336 – 430 Xanh lá
18M GATA178F11 18p11.32 350 – 410 Vàng
18P D18S391 18p11.31 130 – 205 Xanh dương
21A D21S1435 21q21.3 150 – 208 Xanh dương
21B D21S11 21q21.1 215 – 290 Xanh dương
21C D21S1411 21q22.3 245 – 345 Vàng
21D D21S1444 21q22.13 440 – 495 Xanh dương
Bảng 2.2. Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 2 [13].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
13E D13S800 13q22.1 180 – 230 Vàng
13F D13S252 13q12.2 255 – 320 Xanh dương
18D-2 D18S386 18q22.1 336 – 430 Xanh lá
18G D18S1002 18q11.2 325 – 380 Xanh dương
18J D18S976 18p11.31 440 – 495 Vàng
21G D21S1446 21q22.3 435 – 495 Xanh lá
21H D21S1442 21q21.3 362 – 420 Vàng
21J D21S2055 21q22.2 385 – 485 Xanh dương
AMEL XY
AMELX,
AMELY Xp22.2, Yp11.2 X = 104
Y = 110 Xanh dương
SRY SRY Yp11.31 236 Xanh dương
T1 7X 7q34
Xq13
7 = 181
X = 201 Xanh lá
T3 3X 3p24.2
Xq21.1
3 = 133
X = 137 Xanh dương
X1 DXS1187 Xq26.2 120 – 170 Xanh lá
X2 DXS981 Xq13.1 262 – 300 Xanh lá
X3 XHPRT Xq26.2-q26.3 265 – 308 Vàng
X9 DXS2390 Xq27.1-q27.2 312 – 357 Vàng
XY2 DXYS267 Xq21.31, Yp11.31 175 – 217 Xanh dương
XY3 DXYS218 Xp22.33, Yp11.32 215 – 260 Xanh lá
ZFYX ZFY, ZFX Yp11.31, Xp22.11 157 – 166 Vàng
Nếu kết quả của 2 phản ứng không cung cấp đủ thông tin để chẩn đoán về 1 NST thường 13, 18, 21 hoặc nhiễm sắc thể giới tính X, Y thì mẫu DNA sẽ được chạy tiếp phản ứng PCR đa mồi khác trong bộ Devyser Resolution với các marker chỉ có trên 1 loại NST cần khảo sát. Bộ kit bao gồm 4 thành phần riêng biệt cho các NST 13, 18, 21 và NST giới tính X,Y. Ở các phản ứng này, bên cạnh các marker được sử dụng giống như hỗn hợp phản ứng PCR 1 và 2 còn có thêm một số marker khác được trình bày như trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các marker bổ sung trong bộ kit Devyser Resolution [14].
Kí hiệu Tên Marker Vị trí trên NST Độ dài (bp) Màu huỳnh quang
13G D13S325 13q14.11 312 – 417 Vàng
18A D18S391 18q11.31 190 – 230 Xanh dương
18I D18S858 18q21.31 360 – 418 Vàng
21I D21S1437 21q21.1 105 – 152 Vàng
X4 DXS8377 Xq21.33 292 – 342 Xanh dương
X5 DXS6854 Xq26.1 392 – 430 Xanh lá
X6 DXS8377 Xq28 430 – 500 Xanh dương
X8 DXS6803 Xq21.31 100 – 140 Xanh dương
Y2 DYS448 Yq11.223 346 – 380 Xanh dương
T2 Xq23
2P23.2
Xq23 2p23.2
X = 117
2 = 122 Vàng
26 chu kỳ
DNA ly trích Hút DNA vào tube M1, M2
Các phản ứng PCR đều được thực hiện trên máy luân nhiệt Master Cycler Pro theo chu trình được cài đặt như sau:
Bảng 2.4. Chu trình PCR
95OC 15 phút 1 chu kỳ
94OC 30 giây
58OC 90 giây
72OC 90 giây
72OC 30 phút 1 chu kỳ
4OC +
Quy trình chuẩn bị PCR được tóm tắt theo sơ đồ 2.3.
Chạy máy PCR
Xếp các tube M1, M2 vào máy PCR
Sơ đồ 2.3. Quy trình chuẩn bị PCR.
Vật liệu – Phương pháp Thực tập Tốt nghiệp
2.2.3. Phương pháp điện di mao quản trên hệ thống ABI 3500
Sản phẩm PCR được phân tách và định lượng bằng hệ thống điện di mao quản ABI 3500.
Quá trình điện di gồm các bước chính:
- Chuẩn bị tube 1,5 ml chứa hỗn hợp gồm 600 l Hi-DiTM Formamide và 12
l 560 SIZER ORANGE đối với kit Devyser Complete (GeneScan ROX đối với kit Devyser Resolution) đã được vortex.
- Bổ sung 10 l hỗn hợp trên vào đĩa 96 giếng vô trùng.
- Hút 1 l của từng mẫu cho vào mỗi giếng có chứa sẵn hỗn hợp trên.
- Đậy đĩa PCR 96 giếng và đưa vào máy điện di mao quản với các thông số được cài đặt như sau: mao quản 50 cm, POP7, điện thế bơm mẫu là 2,5 kV, thời gian bơm mẫu là 20 giây, điện thế điện di là 19,5 kV và thời gian điện di là 1.700 giây.
2.2.4. Phân tích kết quả bằng phần mềm Gene Marker
Sau khi điện di mao quản, kết quả sẽ được xuất ra dưới dạng tập tin .fsa và chuyển sang máy tính để phân tích bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả tiêu chuẩn phân tích, đánh giá thực hiện theo “Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch bội bằng QF-PCR, phiên bản 3.01 năm 2012” của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh [22]. Theo đó:
Chỉ phân tích các marker có tín hiệu từ 50 rfu (relative fluorescent unit) đến 6.000 rfu. Không phân tích các marker có tín hiệu < 50 rfu hoặc > 6.000 rfu.
Các marker dị hợp tử có 2 alen được phân tích bằng cách tính tỉ số giữa các tín hiệu (tín hiệu của alen ngắn / tín hiệu của alen dài).
Kết luận về số lượng NST phụ thuộc vào tỷ số giữa các alen trong cùng một marker được trình bày tóm tắt như bảng 2.5. Nếu khoảng cách giữa 2 alen < 24bp thì áp dụng tiêu chuẩn 1, nếu khoảng cách giữa 2 alen 24bp thì áp dụng tiêu chuẩn 2.
Bảng 2.5. Đánh giá tỷ lệ giữa các alen trong cùng một marker [15].
Marker Tỷ lệ giữa các alen