Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Phương pháp thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh
a. Phương pháp nhận dạng và thu thập mẫu (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L.
và Phan H.T. 2009)
Bệnh đốm trắng trên thanh long xuất hiện trên bẹ hoặc trái ban đầu là những chấm nhỏ li ti nhƣ kim, phát triển thành những đốm nhỏ màu trắng, vết bệnh trũn thấp so với bẹ, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lên vết ghẻ màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng.
Chọn mẫu ở giai đoạn khi là những chấm nhỏ li ti, đốm nhỏ màu trắng để phân lập tác nhân gây bệnh.
b. Phương pháp phân lập nấm bệnh (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)
Mục đích: nhằm phân lập đƣợc nấm trên mô bệnh Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị:
- Cành thanh long bị bệnh lạ cần phân lập.
- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trường nuôi cấy WA (2%).
Các bước phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh như sau:
- Rửa mẫu bệnh dưới nước máy để loại bỏ đất và bụi bẩn.
- Dùng cồn ethanol 70% lau sạch bụi bẩn xung quanh vết bệnh.
- Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm, cho vào cồn ethanol 96% trong 5 giây, rửa lại bằng nước cất, vớt ra để lên giấy thấm nước sau đó đặt lên môi trường agar - nước cất. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho nấm phát triển.
c. Phương pháp cấy truyền (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T.
2009)
38
Mục đích của giai đoạn này là giúp xác định vi sinh vật nào đã đƣợc phân lập.
Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị:
- Đĩa nấm bệnh đã nuôi cấy trên môi trường WA (2%).
- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trường PDA.
Quy trình cấy truyền
- Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dưới kính lúp soi nổi và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy.
- Xác định xem có nhiều hơn một loại nấm mọc lên hay không.
- Cấy truyền khi sợi nấm mọc đƣợc khoảng 5 mm từ miếng cấy.
- Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường PDA Sau khi cấy truyền các mẫu nấm có trong mẫu cấy ban đầu, ta tiến hành làm thuần các mẫu nấm từ các mẫu nấm cấy truyền.
d. Phương pháp làm thuần (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)
Mục đích của phương pháp này là đảm bảo nấm được cấy hoàn toàn thuần Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị:
- Đĩa nấm bệnh đã được cấy truyền trên môi trường PDA.
- Đĩa petri vô trùng có chứa sẵn môi trường PDA.
Cách thực hiện
Dùng que cấy dẹp đã khử trùng, lấy một miếng thạch nhỏ chứa phần đỉnh của một sợi nấm duy nhất trên đĩa nấm đã cấy truyền cấy sang đĩa môi trường PDA. Kí hiệu tên mẫu cấy, ngày cấy.
e. Phương pháp làm phòng ẩm (Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T.
2009; Phạm Minh Nhựt, 2010)
39
Mục đích của việc quan sát dưới kính hiển vi là để nhận ra tác nhân gây bệnh và chuẩn đoán bệnh.
Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị:
- Đĩa petri có chứa nấm bệnh đã đƣợc làm thuần.
- Đĩa petri vô trùng có chứa môi trường PDA.
- Đĩa petri có chứa một lớp mỏng bông gòn thấm nước phía dưới, đặt giấy lọc lên trên, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút.
- Lame, lamelle vô trùng.
- Nước cất vô trùng.
Cách thực hiện
- Dùng kẹp gắp miếng lame đặt vào giữa đĩa petri vô trùng có chứa bông gòn và giấy lọc.
- Đĩa petri chứa môi trướng PDA, dùng dao mổ cắt thành những miếng hình vuông với kích thước 1 × 1 cm.
- Dùng kẹp gắp miếng môi trường PDA (1 × 1 cm) đặt vào giữa miếng lame.
- Dùng que cấy thước thợ, lấy một ít sinh khối bào tử nấm bệnh cấy vào bốn bên của miếng thạch, đặt lamelle lên miếng thạch vừa cấy xong.
- Đổ nước cất vô trùng vào miếng giấy lọc trong đĩa vừa cấy. Lưu ý là không đổ nước lên lame sẽ ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử.
- Cuối cùng đậy nắp đĩa lại, ghi chú tên mẫu cấy, ngày, giờ cấy.
Tùy thuộc vào thời gian sinh bào tử của từng loài nấm mà sau 3 ngày, 5 ngày hoặc 7 ngày, ta bắt đầu soi bào tử dưới kính hiển vi.
Chuẩn bị:
- Đĩa phòng ẩm
- Kính hiển vi quang học
- Lame, bông gòn thấm nước vô trùng
40 - Cồn 960, methylen blue, dầu soi kính Cách thực hiện
- Dùng bông gòn lau lame bằng cồn 960.
- Nhỏ 1 giọt methylen blue lên lame, sau đó dùng kẹp gắp lamelle trong đĩa phòng ẩm đặt lên giọt methylen blue, soi ở vật kính 10X để xem hình thái sợi nấm.
- Sau đó, cho 1 giọt dầu soi kính lên miếng lamelle, soi ở vật kính 100X.
f. Phương pháp lây bệnh nhân tạo (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014; Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009)
Mục đích: thông thường mục đích của phương pháp lây bệnh nhân tạo, nhằm khẳng định một vi sinh vật đƣợc phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch.
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Công thức 1: Phun nước cất vô trùng (đối chứng) - Công thức 2: Phun nấm Fusarium
- Công thức 3: Phun nấm Colletotrichum - Công thức 4: Phun chủng nấm N1
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên cành thanh long khỏe chƣa có dấu vết bị thương. Mỗi công thức nhiễm 4 cành, mỗi cành gây 10 vết thương bằng cách dùng kim châm nhẹ lên cành tạo vết thương.
Các bước thực hiện
- Dùng bông thấm nước lau sạch vết bụi bẩn trên các cành cây thanh long. Phun nước cất vô trùng cho ướt các cành cây thanh long.
- Đối với mẫu thí nghiệm: Một mẫu dùng kim tiêm gây vết thương trên các cành thanh long. Sau đó, dùng bình xịt chứa bào tử nấm bệnh phun lên các cành đã gây vết thương.
- Đối với mẫu đối chứng: Dùng kim tiêm gây vết thương nhưng không phun dịch bào tử mà phun nước cất vô trùng.
41
- Đặt mẫu nơi thoáng mát có độ ẩm cao, tránh ánh nắng trực tiếp, ghi chú tên mẫu nấm bệnh được lây bệnh và ngày lây bệnh. Mỗi ngày, tưới nước 2 lần vào sáng sớm và lúc chiều tối trừ 2 ngày đầu khi mới lây bệnh.
- Kiểm tra và so sánh những cành đƣợc lây bệnh với mẫu đối chứng. Quan sát, ghi nhận các triệu chứng và so sánh với các triệu chứng của mẫu thu đƣợc từ đồng ruộng.
Lưu ý: Để làm thí nghiệm này, ta nên chọn những cành thanh long khỏe, không bị nhiễm bệnh.Trong dịch bào tử nấm nên cho vài giọt tween 80 giúp tăng khả năng bám dính của bào tử nấm vào vết thương.Thời gian phun tốt nhất là vào buổi chiều tối khoảng 17g. Lúc này không còn ánh sáng mặt trời nên hiệu quả sẽ đạt cao nhất.
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian xuất hiện bệnh, tỷ lệ bệnh và quan sát triệu chứng xuất hiện vết bệnh của từng nghiệm thức ghi nhận bằng hình ảnh sau khi lây bệnh.
Hình 2.2. Dịch bào tử sau khi lắc (a. Colletotrichum, b. Chủng nấm N1, c. Fusarium)
Hình 2.3. Cành thanh long trước khi lây bệnh nhân tạo
a b c
42
2.3.1.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh
a. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014)
Nguyên tắc: Ánh sáng mặt trời là nguồn năng lƣợng chủ yếu của quá trình quang hợp vì vậy rất cần cho các vi sinh vật. Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật khác nhau có sự sinh trưởng và phát triển khác nhau với các mức độ chiếu sáng khác nhau. Do đó, việc khảo sát các điều kiện chiếu sáng khác nhau (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12 giờ tối) là cần thiết để xác định điều kiện chiếu sáng phù hợp cho việc nuôi cấy vi sinh vật và qua đó tìm điều kiện thích hợp phòng trừ một số vi sinh vật gây hại cho vật chủ.
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Công thức 1: 24 giờ chiếu sáng - Công thức 2: 12 giờ sáng: 12 giờ tối
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri.
Tiến hành thí nghiệm
- Dùng cây đục lỗ đường kính 5 mm, đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa sinh khối nấm bệnh.
- Dùng dao cấy chuyển cục thạch vừa đục xong sang đĩa môi trường PDA vô trùng đã chuẩn bị sẵn.
- Ghi chú tên nấm, ngày, giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Trong đó, 1 mẫu thí nghiệm để nơi có đèn chiếu sáng liên tục, 1 mẫu thí nghiệm để nơi có ánh sáng chiếu 12 giờ và 12 giờ không chiếu sáng.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Đo đường kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC).
- Đường kính trung bình tính theo công thức: 𝑑 = d1+ d2
2
(Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố).
43
b. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh (Phan Thị Thu Hiền và ctv, 2014; Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2014)
Nguyên tắc: Độ pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật.
Mỗi loài vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. pH của môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+. Nồng độ ion H+ thay đổi sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích ở thành tế bào, điều này ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ khoáng, các acid hữu cơ, làm giảm khả năng sử dụng dinh dƣỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đó, pH còn ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, sự hình thành ATP cũng như ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử đối với tế bào nấm. Do đó, việc khảo sát ảnh hưởng của pH là cần thiết để xác định khoảng pH phù hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật nhằm tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy.
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau:
- Công thức 1: pH 5 - Công thức 2: pH 6 - Công thức 3: pH 7 - Công thức 4: pH 8
Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri.
Tiến hành
- Dùng cây đục lỗ đường kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh.
- Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa môi trường PDA. Ghi chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Đo đường kính tản nấm (mm) ở 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy (NSC).
- Đường kính trung bình tính theo công thức: 𝑑 = d1+ d2
2
(Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố).
44
c. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh (N. Khattabi và ctv, 2004; R. K. Jayaswal và ctv, 2003).
Nguyên tắc: Nguồn nitơ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Chúng là thành phần cấu tạo của các amino acid, ATP,… nên có ảnh hưởng lớn đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật cũng như khả năng hình thành bào tử của nấm sợi. Do đó, việc khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ là cần thiết để xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật.
Thí nghiệm đƣợc bố trí với các công thức nhƣ sau:
- Công thức 1: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,28 g/l - Công thức 2: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,28 g/l
- Công thức 3: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,28 g/l - Công thức 4: Urê ((NH2)2CO) – lƣợng nitơ 0,14 g/l
- Công thức 5: Kali nitrate (KNO3) – lƣợng nitơ 0,14 g/l
- Công thức 6: Ammonium sulphate ((NH4)2SO4) – lƣợng nitơ 0,14 g/l - Công thức 7: Không bổ sung nitơ
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường WA
Cách thực hiện
- Dùng cây đục lỗ đường kính 5 mm khoang lỗ thạch trên sinh khối nấm bệnh.
- Dùng dao mỗ cấy truyền lỗ thạch sang đĩa petri chứa môi trường PDA. Ghi chú tên nấm, ngày giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy.
Đường kính được tính theo công thức: 𝑑 =d1+ d2
2
(Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố).
45
2.3.1.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp.
với nấm Cochliobolus lunatus (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2012; Tô Duy Khương, 2007)
a. Nguyên tắc
Trong quần thể vi sinh vật, các loài vi sinh vật tác động qua lại, loài này có khả năng kiểm soát và điều hòa số lƣợng của loài khác qua cơ chế đối kháng hay cạnh tranh.
b. Bố trí thí nghiệm gồm các nghiệm thức sau
- Nấm Trichoderma virens đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus - Nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nấm Cochliobolus lunatus - Mẫu đối chứng nấm Cochliobolus lunatus
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lăp lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa.
c. Tiến hành thí nghiệm
- Đối với đĩa cấy đối kháng, dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm, vô trùng, khoan lấy một phần thạch ở trên khuẩn lạc nấm bệnh, chọn vị trí có nhiều bào tử nấm, đặt vào đĩa petri có đường kính 90 mm trong môi trường PDA dùng cho nuôi cấy khảo sát tính đối kháng. Đặt khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm.
- Sau đó, hai ngày dùng khoan thạch có đường kính 5 mm, khoan lấy khuẩn lạc nấm Trichoderma đặt vào đĩa petri cũng cách mép đĩa petri 1,0 cm nhƣng ở phía đối diện với nấm bệnh.
- Ở đĩa đối chứng, ta cũng khoan thạch nấm bệnh bằng khoan hình trụ với đường kính 5 mm, đặt khoan thạch vào đĩa petri cùng loại chứa môi trường PDA vô trùng, khoan thạch cách mép đĩa petri 1,0 cm.
d. Chỉ tiêu theo dõi