3.1. Kết quả nhận dạng, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành
3.1.2. Kết quả lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch
Qua quá trình phân lập, kết quả phân lập đƣợc 3 loại nấm với tần suất xuất hiện khác nhau. Vì vậy để xác định 3 loại nấm là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cành
a b c
56
thanh long. Sinh viên đã tiến hành nhiễm lại các nấm phân lập đƣợc từ cành thanh long bị bệnh đốm trắng lên cành thanh long khỏe. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh của 3 loại nấm trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo
Công thức
Số cành thanh long
nhiễm bệnh
Số vết bệnh bị
nhiễm
Tỷ lệ các cành nhiễm
bệnh
Tỷ lệ vết bệnh xuất
hiện
Đối chứng (nước cất) 4 cành 40 0 0
Fusarium 4 cành 40 0 0
Colletotrichum 4 cành 40 0 0
Chủng nấm N1 4 cành 40 100% 90%
Hình 3.7. Cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo (a. Đối chứng, b. Fusarium, c.
Colletotrichum, d và e. Chủng nấm N1)
Từ số liệu bảng 3.5 cho thấy, nấm Fusarium và Colletotrichum có tỷ lệ vết bệnh xuất hiện giống công thức đối chứng là không có vết bệnh nào xuất hiện sau khi lây bệnh nhân tạo. Chẳng những không xuất hiện vết bệnh mà ở cả 3 công thức: đối chứng, nhiễm nấm Fusarium và nhiễm nấm Colletotrichum cành thanh long vẫn phát triển bình thường và lên chồi mới. Chứng tỏ nấm Fusarium và Colletotrichum hoàn toàn không gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long ruột trắng. Đồng thời, ở kết quả phân
a b c
d e
57
lập tác nhân gây bệnh đốm trắng, tần suất xuất hiện của hai chủng nấm Fusarium và Colletotrichum lần lƣợt là 23,33% và 10% sau 3 lần phân lập. Nấm Fusarium có thể là nấm hoại sinh do nấm Fusarium phân lập đƣợc khi vết bệnh đem cấy đã cũ hoặc lâu ngày. Khi đó, vết bệnh có dấu hiệu bị hỏng nên nấm Fusarium dễ xuất hiện hơn. Sở dĩ, chúng xuất hiện ở vết bệnh hỏng là do nấm Fusarium thuộc loại nấm ký sinh cơ hội, khi đối tƣợng ký chủ có dấu hiệu hỏng thì nấm Fusarium sẽ tấn công và ký sinh lên trên vất bệnh đó. Theo Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), nấm Fusarium thuộc lớp phụ Hypomycetes. Lớp này phần lớn là nấm hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật. Đối với nấm Colletotrichum, nấm này có thể là nấm gây bệnh thán thƣ trên thanh long do nấm này có phổ ký chủ rộng, chúng có thể tồn tại trong xác bã thực vật trong vườn. Sở dĩ phân lập đƣợc nấm Colletotrichum có thể do trong quá trình phân lập lấy ở vị trí gần vết đốm vàng gần mép cành. Đối với chủng nấm N1, đây là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long, sau khi lây bệnh nhân tạo theo phương pháp Koch, tỷ lệ các cành nhiễm bệnh là 100% và tỷ lệ vết bệnh xuất hiện là 90%. Ngoài ra, ở những vị trí vết bệnh xuất hiện, qua thời gian dài, vết bệnh bắt đầu lan rộng về diện tích và chuyển sang màu đen, có thể là do có những sợi nấm mọc trên vết bệnh. Với kết quả này, lại một lần nữa khẳng định chủng nấm N1 là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long.
Tuy nhiên, để xác định chính xác tác nhân cũng nhƣ để chứng minh những nghi ngờ trên đúng là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long, một căn bệnh đang là nổi lo, nổi bức xúc của các nhà vườn, sinh viên tiến hành phân lập lại tác nhân gây từ vết bệnh ở những cành thanh long bị nhiễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo theo phương thức Koch. Kết quả phân lập lại được thể hiện trong bảng 3.6
58
Bảng 3.6. Hình thái chủng nấm N1 trước Koch và sau Koch
Chỉ tiêu quan sát Trước Koch Sau Koch
Hình thái tản nấm
Tản nấm khi mới mọc, mặt trước có màu trắng, sau đó có màu nâu, từ màu
nâu sang nâu đen, giống lông, min nhƣ nhung hoặc kết cấu lỏng lẻo. Mặt dưới
tản nấm có màu đen
Tản nấm tròn có hình thể giống nhƣ lông, mịn, dày,
ban đầu có màu trắng sau đó chuyển qua màu nâu đến nâu đen. Mặt sau tản nấm có màu đen không có
vòng tròn đồng tâm.
Hình thái sợi nấm Sợi nấm có màu xám đến nâu, có vách ngăn
Sợi nấm có vách ngăn, không màu chuyển thành màu nâu hoặc nâu sậm khi
già
Hình dạng bào tử
Bào tử của chúng có vách ngăn, bào tử tách ra hoặc
nằm theo nhóm, thẳng hoặc uốn cong. Bào tử có
3 vách ngăn, 4 tế bào, hiếm khi có 4 vách ngăn, có màu nhạt đến nâu sậm.
Bào tử có 3 vách ngăn, 4 tế bào, bào tử tách ra hoặc
nằm theo nhóm, thẳng hoặc cong, có màu từ nhạt
đến sậm khi già.
Đường kính tản nấm (mm)
sau 5 ngày nuôi cấy 81,67 ± 1,53 82,33 ± 3,79
Nhƣ vậy, sau khi so sánh các đặc điểm đặc trƣng về hình thái tản nấm, sợi nấm, bào tử và đường kính tản nấm ở 5 ngày sau cấy của chủng nấm N1 trước Koch và sau Koch đều có những đặc điểm mô tả hoàn toàn giống nhau. Điều này có thể khẳng định chắc chắn rằng tác nhân gây bệnh trên cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo chính
59
là nấm gây bệnh đốm trắng trên cành thanh long thu thập được trong vườn của nông dân.
Để xác định tên khoa học của chủng nấm N1 gây bệnh đốm trắng trên thanh long, sinh viên đã gửi chủng nấm đi định danh tại phòng xét nghiệm của Công ty Nam Khoa – Biotek. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử sau khi giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH, cho kết quả hoàn toàn khác với kết quả nghi ngờ của chúng tôi. Kết quả này cho thấy chủng nấm Cochliobolus lunatus mới chính là tác nhân chính gây bệnh đốm trắng trên thanh long. Kết quả này có phần khác với kết quả của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014). Trong nghiên cứu của Nguyễn Thành Hiếu và ctv (2014), tác nhân gây bệnh đốm trắng trên thanh long là do nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA
60
Hình 3.9. Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus
3.2.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus
Ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Đối với các điều kiện chiếu sáng khác nhau, sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng khác nhau. Do đó, việc khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện chiếu sáng khác nhau là cần thiết nhằm tìm ra điều kiện, nguyên nhân phát triển của nấm bệnh và phương pháp phòng trừ bệnh thích hợp. Thế nên sinh viên đã khảo sát ảnh hưởng của 2 điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng, 12 giờ sáng: 12 giờ tối). Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.7.
61
Bảng 3.7. Đường kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trường PDA với các điều kiện chiếu sáng khác nhau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng
Mẫu
nấm Ánh sáng Đường kính tản nấm
1NSC 2NSC 3NSC 4NSC
TL trước Koch
SLT 17,17 ± 0,72 23,33b ± 0,76 28b ± 1 30,75b ± 0,66 12S: 12T 17,25 ± 0,43 27,33a ± 0,29 36,83a ± 0,76 45,33a ± 0,58
CV % 3,10 9,27 15,13 15,96
TL sau Koch
SLT 17,09b ± 0,87 31,25b ± 1,30 39,08b ± 2,79 45,33b ± 2,89 12S: 12T 19,25a ± 0,43 40,17a ± 0,38 53,08a ± 0,88 68,67a ± 1,26
CV % 7,37 13,89 17,11 22,69
Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, TL trước Koch:
Mẫu nấm Cochliobolus lunatus phân lập trên cành thanh long bị bệnh, TL sau Koch: Mẫu nấm Cochliobolus lunatus phân lập từ cành thanh long sau khi lây bệnh nhân tạo, CV: Hệ số biến thiên, SLT: Sáng liên tục (hay 24 giờ chiếu sáng), 12S:12T: 12 giờ sáng: 12 giờ tối, các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.
Kết quả nghiên cứu với điều kiện chiếu sáng (24 giờ chiếu sáng và 12 giờ sáng:
12 giờ tối) đƣợc trình bày ở bảng 3.7 cho thấy các mẫu nấm Cochliobolus lunatus đều có khả năng sinh trưởng và phát triển.
Mẫu nấm Cochliobolus lunatus trước Koch đường kính trung bình ở 2 điều kiện chiếu sáng khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở 1NSC. Tuy nhiên ở 2NSC, 3NSC, 4NSC đường kính trung bình lại có sự khác biệt về mặt thống kê, đường kính trung bình của mẫu nấm ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối lớn hơn so với điều kiện 24 giờ chiếu sáng. Mức ánh sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối nấm sinh trưởng và phát triển tốt hơn với đường kính trung bình tản nấm sau 2NSC, 3NSC, 4NSC lần lượt là 27,33 (mm), 36,83(mm), 45,33 (mm).
Đối với mẫu nấm Cochliobolus lunatus sau Koch, đường kính trung bình ở 2 điều kiện chiếu sáng có sự khác biệt về mặt thống kê qua các ngày sau cấy. Điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối, nấm sinh trưởng và phát triển tốt hơn điều kiện
62
chiếu sáng 24 giờ với đường kính trung bình tản nấm qua 1NSC, 2NSC, 3NSC, 4NSC lần lƣợt là 19,25 (mm), 40,17 (mm), 53,08 (mm), 68,67 (mm).
So sánh với kết quả nghiên cứu của Adeniyi, D.O. và ctv (2011), Y. K. Kim và ctv (2005), kết quả của sinh viên phù hợp với kết quả của các tác giả.
Nhìn chung, ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cochliobolus lunatus. Điều này có thể giải thích vì sao nấm gây bệnh đốm trắng trong vụ khô phát triển thấp hơn trong vụ mƣa. Giải thích điều này là vì trong mùa khô ẩm độ thấp và lƣợng mƣa ít hơn nên ít thuận lợi cho sự phát triển của nấm so với trong mùa mưa. Mặt khác trong mùa khô người nông dân thường chong đèn nên điều này cũng làm hạn chế sự phát triển của nấm.
Hình 3.10. Đường kính trung bình của nấm Cochliobolus lunatus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau qua 4 ngày sau cấy (a. SLT trước Koch, b. 12S:12T trước Koch, c. SLT
sau Koch, d. 12S:12T sau Koch)
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus
Các yếu tố môi trường đặc biệt là pH ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm bệnh. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố pH môi trường tới sự sinh trưởng của nấm Cochliobolus lunatus là điều rất cần thiết để từ đó biết đƣợc khả năng sinh trưởng thích hợp của loài nấm này ở khoảng pH nào, từ đó đưa biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất.
a b c d
63
Bảng 3.8. Đường kính trung bình tản nấm của các mẫu Cochliobolus lunatus trên môi trường PDA ở các mức pH khác nhau
Mấu
nấm pH Đường kính tản nấm
1NSC 2NSC 3NSC 4NSC
TL
5 17,29a ± 0,29 38,33b ± 0,58 51,83ab ± 2,08 69,67b ± 0,14 6 17,67a ± 0,52 38,25b ± 0,43 50,75b ± 3,13 70,08b ± 0,38 7 17,83a ± 0,52 40a 55,33a ± 0,76 72,58a ± 0,38 8 15b ± 0,5 29,42c ± 0,38 40,33c ± 0,88 51,08c ± 1,59
CV (%) 7,8 11,91 12,26 13,68
Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, TL: Mẫu nấm Cochliobolus lunatus được phân lập từ cành thanh long bị bệnh, CV: Hệ số biến thiên, các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của pH được trình bày ở bảng 3.8 cho thấy nấm Cochliobolus lunatus đều có khả năng sinh trưởng và phát triển được ở các mức pH từ 5 – 8. Ở mỗi thời điểm khác nhau đường kính tản nấm phát triển cũng khác nhau nhƣng nhìn chung thì pH thích hợp cho sự phát triển của tản nấm qua 4 ngày sau cấy vẫn là pH 7 với đường kính trung bình tản nấm là 72,58 (mm) sau đó đến pH 5, pH 6 với đường kính tản nấm lần lượt là (69,67) mm và 70,08 (mm), cuối cùng là pH 8 với đường kính là 51,08 (mm).
Đối chứng với kết quả nghiên cứu của Gao Ying và ctv (2009), Khailare, V.C và Rafi Ahmed (2012), Kishore và ctv (2009) và Prasad và ctv (1992), kết quả nghiên cứu của sinh viên khá phù hợp với kết quả của các tác giả trước.
Tóm lại, pH thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển đường kính tản nấm Cochliobolus lunatus là pH 7, kế đến là pH 5, pH 6 và sau cùng trong thí nghiệm này là pH 8. Như vậy, nấm C. lunatus có khả năng sinh trưởng ở môi trường hơi acid đến trung tính.
64
Hình 3.11. Đường kính trung bình tản nấm Cochliobolus lunatus trên môi trường PDA ở các mức pH khác nhau qua 4 ngày sau cấy (a. pH 5, b. pH 6, c. pH 7, d. pH 8) 3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trưởng kích thước của nấm Cochliobolus lunatus
Nguồn nitơ là một trong những yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Do đó, sinh viên thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung ở 3 dạng urê ((NH2)2CO), kali nitrate (KNO3), ammonium sulphate ((NH4)2SO4) và kết quả đạt được có sự khác biệt giữa 3 nguồn nitơ bổ sung vào môi trường WA.
Bảng 3.9. Đường kính trung bình tản nấm của mẫu nấm Cochliobolus lunatus trên môi trường WA có bổ sung nguồn nitơ khác nhau
Lƣợng
nitơ Nguồn nitơ Ngày sau cấy
1NSC 2NSC 3NSC 4NSC
0,28 g/ l
(NH2)2CO 12,83c ± 0,14 26,92c ± 0,14 40,75b ± 0,25 50.67b ± 0,38 KNO3 16,5a ± 0,25 33,83a ± 0,29 52,17a ± 0,52 67,17a ± 0,14 (NH4)2SO4 15,42b ± 0,14 27,58b ± 0,14 39c ± 0,52 48c ± 0,66
Không bổ
sung 12,33c ± 0,58 25,17d ± 0,29 36,25d ± 0,66 45,17d ± 0,14
CV (%) 12,88% 12,07% 15,09% 16,94%
0,14 g/ l
(NH2)2CO 12,58b ± 0,14 25,42c ± 0,29 38,25b ± 0,43 48,83b ± 0,76 KNO3 12,66b ± 0,29 28,92a ± 0,14 45,92a ± 0,52 59,5a ± 0,75 (NH4)2SO4 14,92a ± 0,14 26,75b ± 0,25 37,42b ± 0,29 45,75c ± 0,76
Không bổ
sung 12,33b ± 0,58 25.17c ± 0,29 36,25c ± 0,66 45,17c ± 0,14
CV (%) 8,58% 5,90% 10,10% 12,12%
Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NSC: Ngày sau cấy, CV: Hệ số biến thiên, các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%.
a b c d
65
Kết quả ảnh hưởng của nguồn nitơ được trình bày ở bảng 3.9 cho thấy nấm Cochliobolus lunatus đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường WA có bổ sung nguồn nitơ và lƣợng nitơ khác nhau. Tuy nhiên, ở mỗi nguồn nitơ và lƣợng nitơ khác nhau chủng nấm Cochliobolus lunatus lại có khả năng sinh trưởng và phát triển khác nhau.
Ở các nguồn nitơ khác nhau với lượng nitơ 0,28 g/l, đường kính tản nấm C.
lunatus tăng dần qua 4 ngày sau cấy. Ở thời điểm 1 ngày sau cấy, nguồn nitơ bổ sung dưới dạng KNO3 cho tốc độ phát triển mạnh nhất với đường kính trung bình tản nấm là 16,5 mm, kế đến là (NH4)2SO4 và sau cùng là (NH2)2CO và không bổ sung nitơ. Sau thời điểm 2, 3, 4 ngày sau cấy, nguồn nitơ bổ sung dưới dạng KNO3 vẫn cho tốc độ phát triển mạnh nhất so với 3 nguồn nitơ còn lại, với đường kính trung bình tản nấm ở 4 ngày sau cấy của nguồn KNO3 là 67,17 (mm). Đối với các nguồn nitơ còn lại có sự khác biệt, ở thời điểm 3, 4 ngày sau cấy nguồn nitơ bổ sung dưới dạng (NH2)2CO lại cho đường kính tản nấm phát triển mạnh hơn (NH4)2SO4 với đường kính trung bình tản nấm là 50,67 (mm) đối với (NH2)2CO và 48 (mm) đối với (NH4)2SO4. Còn đối với môi trường không bổ sung nguồn nitơ, nấm C. lunatus phát triển chậm nhất do thiếu nguồn dinh dƣỡng cung cấp cho sự phát triển của nấm C. lunatus.
Đối với lượng nitơ là 0,14 g/ l, nhìn chung nguồn nitơ bổ sung dưới dạng KNO3
vẫn cho tốc độ tăng trưởng của nấm C. lunatus vẫn đạt cao nhất ở 2, 3, 4 ngày sau cấy.
Trong đó, ở thời điểm 4 ngày sau cấy, đường kính trung bình tản nấm trên môi trường có chứa KNO3 là 59,5 (mm), kế đến là (NH2)2CO và cuối cùng vẫn là (NH4)2SO4 và không bổ sung nguồn nitơ với đường kính trung bình lần lượt là 48,83 (mm), 45,75 (mm) và 45,17 (mm).
Nguồn nitơ bổ sung ở dạng KNO3 là tốt nhất cho sự phát triển của nấm ở cả hai liều lƣợng. So sánh giữa hai liều lƣợng nitơ (0,28 g/ l và 0,14 g/ l), nấm C. lunatus phát triển đường kính tản nấm ở liều lượng nitơ 0,28 g/ l cao hơn so với 0,14 g/ l trong cùng nguồn nitơ. Điển hình, nguồn nitơ dạng KNO3 với liều lượng 0,28 g/ l có đường kính
66
lớn hơn so với nguồn nitơ dạng KNO3 liều lƣợng 0,14 g/ l với mức ý nghĩa 95% (phụ lục B.3). Điều này giải thích vì sao, bón phân càng nhiều nấm phát triển càng mạnh.
Đối chứng với nghiên cứu của Gao Ying và ctv (2009), Azhar Hussain và ctv (2003), Khattabia và ctv (2004), Basamma (2008), Khilare, V.C. và Rafi Ahamed (2011), kết quả nghiên cứu của sinh viên phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trước.
Tóm tại trong thí nghiệm này, KNO3 là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm C. lunatus, kế đến là (NH2)2CO. Đối với nguồn nitơ có dạng (NH4)2SO4
không phù hợp với sự phát triển của nấm C. lunatus.
Do đó, trong quá trình trồng cây thanh long nên hạn chế bón phân đạm, chỉ bón ở mức độ phù hợp không nên bón thừa phân đạm. Vì khi bón thừa đạm, cây trồng sẽ lớn nhanh, dễ bị đỗ ngã. Mặt khác còn làm tăng khả năng nhiễm bệnh do thiếu sức đề kháng dễ bị nấm bệnh hại tấn công.
Một trong những nguyên nhân làm cho bệnh đốm trắng phát triển mạnh trên thanh long là do cây thanh long có hiệu quả kinh tế cao nên người nông dân đẩy mạnh việc trồng loại cây này để nâng cao thu nhập, mà cây thanh long là loại cây thân leo cành trường, bò trên trụ đỡ nhưng cành thanh long lại chứa lượng nước khá cao; điều này làm cho cành mềm hơn so với những loại cây khác nên dễ bị đỗ ngã, nhiễm bệnh.
Vì thế ngành Nông Nghiệp khuyến cáo người nông dân sử dụng kali nitrate để phun cho cây trồng với mục đích giúp thân cây cứng hơn chống đỗ ngã nhƣng kali nitrate lại là nguồn nitơ tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh. Đồng thời việc sử dụng phân kali nitrate sẽ cho trái có độ ngọt cao hơn, màu vỏ đẹp hơn, vỏ trái cứng chắc và lâu hƣ thối, dễ cất trữ vận chuyển. Ngoài ra, việc phun kali nitrate lên cây thanh long sẽ cho trái có trọng lƣợng nặng hơn so với không phun (Nguyễn Minh Châu, 2001). Vì vậy, để có hiệu quả kinh tế cao người nông dân vừa phun kali nitrate, urê ở trên cây vừa bón lót ở dưới đất để cây mau ra hoa kết quả. Chính những nguyên nhân trên làm cho nấm này phát triển và lây lan nhanh trên thanh long.