Cân 900g cây ngò ôm đƣ đ c ph i khô vƠ nghiền nh , chiết hoƠn l u v i 1lít metanol nhiệt độ 85o (chiết3 lần, mỗi lần 3 gi ) trong bình cầu có ng sinh hƠn.
D ch chiết gộp l i vƠ tiến hƠnh cô quay chơn không thu đ c 76,892 g cao metanol.
Hòa tan cao metanol một l ng t i thiểu metanol, tiếp theo cho n c c t vƠo thƠnh d ng hỗn d ch rồi chiết phơn b n i tiếp v i lần l t các dung môi lƠ n-hexane, diethyl ether, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, ethanol, buthanol thu đ c các d ch chiết t ng ng.
Cao chiết n-hexane: chiết l ng ậ l ng, lắc v i dung môi n-hexan cho đến khi mƠu c a d ch chiết nh t dần, thử trên mặt kính đồng hồ nếu không còn vết thì dừng l i.
Mỗi lần lắc trong vòng 30ph. Chiết 4 lần vƠ mỗi lần lƠ 50mL n-hexan, th i gian tách l p lƠ 15ph. Gộp các d ch chiết rồi tiến hƠnh thu hồi dung môi, thu đ c cao n-hexan.
Cao chiết diethyl ether: bã chiết v i n-hexane đ c lắc chiết tiếp v i Diethyl ether. Chiết l ng ậl ng, lắc v i dung môi diethyl ether cho đến khi mƠu c a d ch chiết nh t dần, thử trên mặt kính đồng hồ nếu không còn vết thì dừng l i. Mỗi lần lắc trong vòng 30ph. Chiết 4 lần vƠ mỗi lần lƠ 50mL diethyl ether, th i gian tách l p lƠ 15ph.
Gộp các d ch chiết rồi tiến hƠnh thu hồi dung môi, thu đ c cao diethyl ether.
Các d ch chiết còn l i ta thực hiện t ng tự, thu đ c các cao chiết t ng ng.
Các cao chiết sau khi thu đ c, trích một l ng nh đem phơn tích GC-MS để xác đ nh thƠnh phần vƠ hƠm l ng các c u tử có trong mỗi cao chiết.
2.3.1. Đoăph ăGC-MS
Thiết b : máy đo sắc kỦ khí ghép phổ GC-MS Agilent v i cột tách mao qu n DB-5MS, khí mang He 10 psi, thể tích tiêm m u 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+ kèm ngơn hƠng dữ liệu vƠ theo ch ng trình gradient nhiệt độ: từ 500C đến 3000C (5 phút); injector 2500C và detector 500, chếđộ quét Fullscan.
Đo t i trung tơm kỹ thu t tiêu chuẩn đo l ng Qu ng Ngƣi Ph ng pháp GC-MS để đ nh danh các ch t trong các d ch chiết.
2.3.2. Phơnăl pvƠăxácăđ nhăcôngăth căc uăt oăch tăs ch
Trong các cao chiết thu nh n đ c khi chiết v i các dung môi n-hexane, dichloromethane, chlorofom, ethyl acetate, diethyl ether, buthanol, methanol. Thông th ng các thƠnh phần hóa học trong d ch chiết n-hexane dễ phơn l p để tách ra kh i nhau h n. Điều nƠy có thể lƠ do các c u tử trong d ch chiết nƠy ít phơn cực nên quá trình phơn l p bằng sắc kỦ cột thì các ch t dễ tách ra kh i nhau. Vì v ychúng tôi chọn m u cao chiết trong n-hexane lƠm m u nghiên c u chi tiết trong khóa lu n t t nghiệp nƠy.
Tiến hƠnh ch y sắc kí cột nhồisilicagel thu đ c các ch t s ch theo s đồ Hình 2.2:
Hình 2.3.ăS ăđ nghiên c u thực nghi m Thơn vƠ rễ cơy Ngò ôm
Xử lỦ s bộ: lƠm s ch, ph i khô, nghiền.
M u bột nguyên liệu
Ngơm v i methanol (3 lần) Lọc
D ch chiết methanol Cô đuổi dung môi Cao methanol
Phơn tán vƠo n c.
Chiết l ng-l ng v i n-hexane
D ch chiết n-hexane D ch n c
Cô đuổi dung môi Cao A
GC-MS Phơn l p
Đ nh danh A Ch t s ch
1H-NMR
13C-NMR
CTCT
Dung môi
D ch chiết Bã
Cô đuổi dung môi
Cao B
GC-MS
Đ nh danh B
Hình 2.2. S ăđ phân l p các ch t từ cao n-hexan Để phân l p và tinh chếch t chúng tôi sử d ng:
- Sắc kí b n m ng TLC Silicagel 60 F254 hƣng Merck, dƠy 0.25 mm tráng trên nền nhôm.
- Silicagel nhồicột là silicagel Merck c h t 0.04 - 0.06 mm.
- Cộtsắc kí là ng th y tinh có kích th c 2 cm x 80 cm, bên d i có van khóa.
- Thu c thử phun lên b n m ng sử d ng vanilin 1% trong dung d ch methanol H2SO4đặc, sau đó s y b nm ng nhiệt độ kho ng 1100C.
a. Chuẩn b thu c thử
L y vƠo bình tam giác 200 mL MeOH, thêm 25 mL CH3COOH, lƠm l nh hỗn h p. Sau đó, thêm từ từ 11 mL H2SO4 đ m đặc.Cơn 1.2 g vanilin. Cho từ từ từng l ng nh vanilin vƠo hỗn h p trên, vừa dùng đũa th y tinh khu y đều.
b. Lựa chọn dung môi ch y cột sắc kí
Đểlựachọn dung môi hay hệ dung môi ch y cộtsắc kí silicagel dựa vào sắc kí b nm ngv i các b c sau:
- Hoà tan hoàn toàn một l ngnh m u trong dung môi CHCl3.
- Chuẩn b 5 t m b n m ng rồi dùng ng mao qu n ch m dung d ch m u trên lên mỗit m v il ngt ngđ ng nhau.
Ch y cột đ o pha H2O: MeOH = 6:4 Ch y cột silicagen các hệ
dung môi đ c lựa chọn
CHCl3 : CH3OH : H2O = 200 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 175 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 150 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 125 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 100 : 25 : 1
A
m =275 mg
B
m = 390mg
C
m =295 mg
D
m = 110mg
E
m = 315mg
B1
m = 10mg
Cao tổng n-hexane m= 9.185 gam
- Mỗi b n m ng đ c ch y v i lo i dung môi có độ phân cực khác nhau:
CHCl3:CH3OH:H2O (v i các t lệ 200:25:1, 175:25:1, 150:25:1, 125:25:1, 100:25:1), CHCl3:MeOH (99:1), CHCl3:CH3COCH3 (8:2). Tiếp theo hiện hình bằng thu c thử.
B n m ng nào có sự tách vệt rõ ràng, các vệtnằm trong kho ng 1/3 đến 2/3 chiều dài b nm ng thì hệ dung môit ng ngđó là thích h pđể ch ycộtsắc kí.
Sau khi thử nghiệm ch m b n m ng v i cáchệ dung môi khác nhau, chúng tôi đƣ tìm th yhệ dung môi phù h p là CHCl3:CH3OH:H2O.
c. Chuẩn b cột sắc kí
C đ nh cột trên giá. Cho một l p bông m ng vào đáy để ngăn không cho silicagel ch yxu ng bình h ng [2].
Đểviệc tách ch t đ c t t, silicagel ph i đ c n p vào cột một cách đồng nh t để h nchế việc “n t” cột, b t th ng. Silicagel đ c nhồi vào cột sắc kí theo ph ng pháp nhồisệt [2].
Cho hệ dung môi nậhexan vào c c th y tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí b n m ng). Các hệ dung môi đƣ dùng trong quá trình ch y cột:
CHCl3 : CH3OH : H2O = 200 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 175 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 150 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 125 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 100 : 25 : 1
L y 150 gam silicagel cho từ từ từng l ng nh vƠo c c đựng hệ dung môi trên vừa khu y đều để đuổi hết bọt khí, thu đ c một hỗn h p sệt đồng nh t để nhồi vƠo cột sắc kí.
Rót hỗn h p sệt vƠo cột qua một phễu lọc vƠ m nhẹ khoá để dung môi ch y xu ng bình h ng (dung môi nƠy tiếp t c đ c dùng để rót tr l i đầu cột). Tiếp t c rót hỗn h p vƠo cột đến hết s l ng, vừa rót vừa gõ nhẹ thƠnh cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi n p xong cho dung môi ch y đều qua cột hai, ba lần để cột đ c đồng nh t. Nh t thiết không để đầu cột b khô, nghĩa lƠ luôn luôn có dung môi ph trên phần đầu cột. Sau khi n p cột xong, mặt thoáng silicagel ph i phẳng.
d. N p m u vƠo cột
M u đ c n p vƠo cột theo ph ng pháp khô.
9.185g cao n-hexane hòa tan vừa đ bằng CHCl3 trong bình cầu, thêm 5 gam silicagel, quay c t đến khô để ch t gắn đều lên silicagel. LƠm t i m n phần silicagel đƣ gắn m u bằng c i vƠ chƠy s để n p vƠo cột sắc kí.
M u khô đƣ đ c lƠm t i m n đ c cho vƠo cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đƣ khoá cột. Chú Ủ khi cho m u vƠo cột theo ph ng pháp khô thì l ng dung môi ph i vừa đ , không nhiều quá; l ng m u ph i dƠn tr i đều một l p m ng trên bề mặt
silicagel trong cột; m u ph i th m t đều dung môi, không có bọt khí. Cho từng l ng nh dung môi ch y cột vƠo rửa s ch thƠnh cột rồi tiến hƠnh ch y cột
e. Ch y cột đ o pha
Chuẩn b cột [2]
- C đ nh cột trên giá sao cho thẳng đ ng.
- Rửa cột bằng dung môi MeOH. Chú Ủ cần m khóa hết c để dung môi ch y m nh liên t c.
- Khóa l i, đổ dầy dung môi vƠo cột, b t kín đầu trên cột vƠ để cột ổn đ nh trong 1 kho ng th i gian (th ng lƠ 6-8 gi ).
Đ a ch t lên cột
- Hòa tan m u bằng hệ dung môi phơn cực: H2O: MeOH=6:4. M khóa để dung môi thoát ra đến đúng mặt silicagen thì khóa l i.
- Đ a ch t lên cột bằng pipet, chú Ủ cho ch t ch y từ từ theo thƠnh ng tránh việc lƠm m t độ phẳngrắnc a mặt cột.
Ch y cột [2]
- M khóa cho dung môi ch y xu ng đến sát mặt rắn silicagen thì khóa l i, thêm dung môi đến đầy cột, m khóa cho t c độ ch y vừa ph i.
- Trong quá trình vừa h ng vừa ch m thử b n m ng để xem ch t ra khi nƠo.
- Thu d ch rửa d i vƠo ng nghiệm t i dung tích 8-10 mL thì thay ng nghiệm khác.
Lọc qua silicagen hệ H:M = 6:4 thu đ c ch t s ch B1 2.3.3. Xácăđ nhăc uătrúcăc aăh păch tăB1
Để xác đ nh c u trúc c a h p ch t B1 chúng tôi sử d ng kết h p các ph ng pháp phổ:
- Phổ cộng h ng từ h t nhơn 1H - NMR đ c đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
- Phổ 13C - NMR, DEPT đ c đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3.
Công việc nƠy đ c thực hiện viện hóa học Khoa học vƠ Công nghệ Việt Nam.
CH NGă3