2.4.1. Phân tích định tính thành phần nhóm chức các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol
a. Định tính alkaloid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml dung dịch HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửMayer, nếu xuất hiện kết tủa trắng là phản ứng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thửDragendorff, nếu xuất hiện màu cam đỏ là phản ứng dương tính.
- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Wagner, nếu xuất hiện kết tủa màu cam nâu là phản ứng dương tính.
b. Định tính flavonoid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt axit sunfuric đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút, dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là phản ứng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt NaOH 1%/etanol, nếu xuất hiện màu đỏ nâu hoặc đỏ tím là phản ứng dương tính.
- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt AlCl3/etanol 1%, nếu xuất hiện màu xanh lục là phản ứng dương tính.
c. Định tính terpenoid - steroid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15 ml clorofom, khuấy đều, lọc qua giấy lọc,lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch đổi sang màu đỏ
% mcao phân đoạn = x 100 mcao phân đoạn
mcao ethanol
đậm hoặc xanh tímlà phản ứng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt dung dịch vanillin 1% trong etanol, 1 giọt HCl đậm đặc. Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc tímlà dương tính.
- Ống 3: thêm vào 2 giọt anhidric acetic rồi thêm vào tiếp 2 giọt H2SO4 đậm nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc cam đỏ là phản ứng dương tính.
d. Định tính glycosid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, đun cách thủy đến khô. Hòa tan cặn trong 5ml clorofom. Lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính.
- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Keller-Kilian (100ml axit axetic loãng + 1 ml Fe2(SO4)3 5%) và 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu xuất hiện màu xanh lục sau 1-2 phút là phản ứng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Tollens, nếu xuất hiện kết tủa bạc là phản ứng dương tính.
- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Phenol–H2SO4, nếu dung dịch chuyển sang màu nâu là phản ứng dương tính.
e. Định tính phenol
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
- Ống 1: thêm vào 1 ml vanilin 1% trong HCl, dung dịch chuyển sang màu trầm đậm hoặc đỏ là phản ứng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1ml dung dịch FeCl3 5% trong ethanol. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏlà phản ứng dương tính.
- Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Bortrager (KOH 50%/methanol). Nếu xuất hiện màu đỏ, tím hoặc xanh lục là phản ứng dương tính.
f. Định tính tanin
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
- Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Gelatin mặn (NaCl 5g + gelatin 0,5 g hòa tan trong 100 ml nước cất). Nếu xuất hiện trầm hiện màu vàng dương tính.
- Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Stiasny (formol 36% 20 ml + HCl đậm đặc 10 ml). Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ là phản ứng dương tính.
g. Định tính sesquyterpen-lacton
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml chloroform, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào ống nghiệm 5ml dịch lọc, thử bằng thuốc thử Tollen, nếu có lớp gương bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có kết tủa Ag màu đen dưới đáy ống nghiệm thì phản ứng dương tính.
2.4.2. Định danh thành phần hóa học các phân đoạn cao chiết từ tổng cao ethanol bằng phương pháp GC/MS
a. Mục đích
Sàng lọc và định danh các chất có phân tử lƣợng thấp và dễ bay hơi có trong mẫu dựa theo giá trị của thời gian lưu trong sắc ký đồ và các phân mảnh tạo thành trong khối phổ.
b. Điều kiện tiến hành (Chương trình chạy GC/MS)
Mẫu dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4 rồi chạy trên hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ: 7890A/5975C, Agilent technology,USA. Cột sắc ký mao quản: HP- 5: 30 m x 250 àm x 0.25 àm
Buồng tiêm mẫu
- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 280°C Áp suất: 10 psi - Tỷ lệ chia dũng: 5 :1 Thể tớch tiờm: 1 àL
Khối phổ
- Khoảng phổ quét: 28 – 600 m/z
- Nhiệt độ nguồn: 230oC; Nhiệt độ bộ tứ cực: 150oC
Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS và chương trình nhiệt độ lò cột đƣợc thể hiện trên hình 2.11.
Hình 2.4. Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent và chương trình nhiệt độ lò cột