3.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây ba kích tím (Morinda officinalis How).
3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh.
3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: 23/6/2017 – 13/12/2017
- Địa điểm: Hợp tác xã Toàn Dân xã Thanh Lâm huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh.
3.4. Nội dung nghiên cứu
-Điều tra, xác định thành phần và mức độ phổ biến của bệnh hại trên cây ba kích tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh.
-Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lá thối rễ hại cây ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh.
-Nghiên cứu một số đặc điểm và diễn biến của bệnh vàng lá thối rễ hại cây ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Nội dung 1. Điều tra, xác định thành phần và mức độ phổ biến của bệnh hại trên cây ba kích tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh
Tiến hành điều tra, thu thập mẫu bệnh theo “Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng” của Viện Bảo vệ thực vật (1997)[26]. Thu thập các bộ phận của cây trồng điều tra có triệu chứng bị bệnh gây hại. Sử dụng túi giấy để thu và giữ mẫu bệnh. Không sử dụng túi nilon để giữ mẫu tươi vì sẽ tạo độ ẩm trong túi nilon là điều kiện tốt cho vi sinh vật hoại sinh phát triển nhanh và phá hủy mẫu thực vật. Đóng gói mẫu cẩn thận để tránh va đập và ngưng tụ hơi nước. Xử lý mẫu thực vật theo các phương pháp ép khô, giữ tiêu bản màu xanh. Lưu giữ trong hộp kính hay trong phong bì.
19
Điểu tra, thu thập mẫu bệnh hại cây ba kích tím được tiến hành qua phỏng vấn nông dân, điều tra thu thập mẫu bệnh ở giai đoạn vườn ươm, vườn sản xuất ở các độ tuổi khác nhau cũng như bệnh từ năm trước nhưng vấn còn sót lại một số cây ba kích tím.
Thời gian và chu kỳ điều tra định kỳ 1 tháng/lần trên các vườn ba kích tím bị bệnh sản xuất ở các độ tuổi khác nhau từ những năm trước còn sót lại. Chỉ tiêu theo dõi được tính theo số lần điều tra.
3.5.2. Nội dung 2. Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lá thối rễ hại cây ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh
- Hoạt động chẩn đoán, giám định tên khoa học của các đối tượng dịch hại trên cây ba kích tím sẽ được tiến hành tại Viện Bảo vệ thực vật bằng các phương pháp sau:
* Phương pháp xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lá thối rễ ba kích tím:
Các điều tra được tiến hành theo “Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng” của Viện Bảo vệ thực vật (1997)[26] và các tiêu chuẩn ngành có liên quan. (i). Quan sát, phân tích và phân loại triệu chứng; (ii).
Quan sát vi sinh vật gây bệnh dưới kính hiển vi; (iii). Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn, nấm theo các phương pháp chung; (iii). Xác định nguyên nhân gây bệnh theo một số tài liệu như: Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung, 1999, 2001[4][5]; Đặng Vũ Thị Thanh và cs, 2001, 2006[6][7]. Đối với mẫu bệnh do vi rút và phytoplasma gây ra thì sử dụng phương pháp giải mã gene đặc trưng. (v). Xử lý mẫu thực vật theo các phương pháp ép khô, giữ tiêu bản màu xanh. Lưu giữ trong hộp kính hay trong phong bì. Làm tiêu bản lamen mẫu nấm. (vi). Lưu giữ các vi sinh vật gây trên tiêu bản lam, trên giấy khô chân không và trong dầu khoáng.
+ Phân lập nấm gây bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích theo phương pháp của Burgess và cs. (2008)[36]. Khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng Ethanol 70%; cắt mẫu thành từng mẫu nhỏ có kích thước (0,5×0,5mm), đặt các mẫu lên đĩa petri (đường kính 9cm) môi trường WA (20g Agar trong 1 lít nước). Sau khi nấm mọc cấy truyền các nguồn nấm sang môi trường PDA (20g Dextrose + 20g Agar + 250g khoai tây
20
trong 1 lít nước, pH=7.0) và tiến hành tách dòng thuần bằng cách cấy truyền các đỉnh sợi nấm trên môi trường PDA. Quan sát sự phát triển của nấm, mô tả đặc điểm phát triển của tản nấm, sự hình thành bào tử, hình dạng và kích thước bào tử.
Sau khi làm thuần nấm, tiến hành nhân nuôi sinh khối nấm trên môi trường PDA và tiến hành lây nhiễm nhân tạo theo chu trình Koch.
- Lây nhiễm nhân tạo cho cây ba kích tím theo chu trình Koch.
Cây ba kích con 1 năm tuổi được trồng bằng đất đã được khử trùng trong chậu vại. Nhân sinh khối nấm, và lây nhiễm nhân tạo bằng dung dịch bào tử nấm với nồng độ bào tử 5×106 bào tử/ml. Cây đối chứng, không lây bệnh, thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc 30 cây.
Số cây lây nhiễm nhân tạo: 30 cây/thí nghiệm × 3 lần = 90 cây Số cây đối chứng: 30 cây/thí nghiệm × 3 lần = 90 cây
Quan sát thời gian xuất hiện của triệu chứng bệnh vàng lá trên các cây thí nghiệm, mô tả so sánh với triệu chứng bệnh trên đồng ruộng, tính tỷ lệ cây bị bệnh.
Từ các cây lây bệnh nhân tạo có biểu hiện triệu chứng bệnh giống với các triệu chứng bệnh trên đồng ruộng tiến hành phân lập lại nấm và so sánh với loài nấm đã sử dụng trong lây bệnh nhân tạo.
3.5.3. Nội dung 3. Nghiên cứu một số đặc điểm và diễn biến của bệnh vàng lá thối rễ hại cây ba kích tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh
a. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của nấm gây bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích tím trên các môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau
Nuôi cấy nấm trên đĩa petri (đường kính 9cm) chứa các môi trường Cà rốt- Agar (200g củ cà rốt tươi + 20g Agar/1 lít nước), Czapek-Dox Agar (30g Sucrose + 2g NaNO3+ 31g K2PO4.3H2O + 0,5g MgSO4.7H2O + 0,5g KCl + 0,01g FeSO4.7H2O + 15g Agar + nước vừa đủ (tại 25oC) ±0,2), PDA (20g Dextrose + 20g Agar + 250g khoai tây + nước cất vừa đủ 1 lít, pH=7.0), YMA(0,5g K2HPO4 + 0,2g MgSO4.7H2O + 0,1g NaCL + 10g Mannintol + 0,5g Cao nấm men + 0,5g CaCO3 + Dung dịch Công gô 1% + 20 Agar + nước cất vừa đủ 1 lít, pH=6,8-7,0) và Bột đậu Agar (20g bột đậu khô + 20g Agar/1 lít nước). Điều kiện nhiệt độ bao gồm: 25, 30
21
và 35oC. Theo dõi sự phát triển của tản nấm trên các môi trường sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy, quan sát thời gian hình thành bào tử và mức độ sản sinh bào tử. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa petri.
b. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của nấm ở các mức pH khác nhau trên môi trường PDA
Nuôi cấy nấm trên môi trường PDA ở các mức pH 6,0; 7,0 và 8,0 đặt ở trong khoảng nhiệt độ 25, 30 và 35oC. Theo dõi sự phát triển của tản nấm sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy, quan sát mức độ hình thành bào tử. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri.
c. Nghiên cứu diễn biến của bệnh vàng lá thối rễ hại trên cây ba kích tím tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh
Vườn ba kích tím được điều tra là những vườn đại diện cho từng tuổi cây và từng địa hình vườn trồng tại huyện Ba Chẽ:
+ Vườn 1 năm tuổi + Vườn 2 năm tuổi + Vườn 3 năm tuổi
Mỗi loại hình vườn chọn 3 vườn đại diện, mỗi vườn điều tra 10 điểm chéo góc, mỗi điểm 15 cây, điều tra định kỳ 1 lần/tháng.
Chỉ tiêu theo dõi:
3.6. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được dùng phần mềm excel và chương trình SAS để xử lý.
TLB (%) = Tổng số cây bị nhiễm bệnh
Tổng số cây điều tra × 100
22
PHẦN 4