CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Phương pháp định tên bằng sinh hóa và sinh học phân tử
Phương pháp nhuộm Gram:
Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để xác định hình thái tế bào và hình thái bào tử.
Mục đích: Bacillus là trực khuẩn G + và có khả năng sinh bào tử. vì vậy ta dùng phương pháp nhuộm gram và soi mẫu trên kính hiển vi để quan sát hình thái, kết luận.
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ. Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững. Vì thành phần tế bào của mỗi vi sinh vật khác nhau nên khả năng bắt màu cũng khác nhau. Dựa vào sự bắt màu khác nhau này mà chia vi khuẩn ra làm hai nhóm G + bắt màu tím và G – bắt màu hồng.
Cách tiến hành: Sau khi nuôi vi khuẩn trên đĩa thạch 24h thì cất vào tủ lạnh 24h để tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh bào tử. Sau đó bắt đầu quá trình nhuộm nhƣ sau:
Bước 1. Làm vết bôi và cố định tiêu bản để làm chết vi khuẩn và giữ vi khuẩn cố định trên kính không bị trôi trong quá trình nhuộm.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhuộm tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút. G+ và G- đều bắt màu tím do màu thấm vào lớp peptidoglycan của G+ và màng ngoài của G-.
Bước 3: Thêm dung dịch Lugol, để 1 phút. G+ và G- có màu tím đậm hơn do iot tạo phức chất màu với tím tinh thể và cố định màu.
Bước 4: Tẩy bằng cồn 96o (15-30 giây). G+ cồn làm cho các lỗ peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iot bị giữ lại trong tế bào.
G- do cồn làm tan lớp màng ngoài có màu, bản chất là lipid dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot, do đó trong giai đoạn này G- sẽ mất màu.
Bước 5: Nhuộm bằng dịch fucsin trong 30-60 giâyđể nguội rồi rửa lại bằng nước cất. G+ vẫn giữ màu tím do không bắt màu fuchsin còn G- bắt màu hồng.
Bước 6: Để khô hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhỏ 1 giọt dầu soi kính.
Soi kính với vật kính dầu độ phóng đại 100 lần.
Với phương pháp nhuộm Gram như trên, G+ giữ lại màu tím, G- giữ lại màu hồng. Vi khuẩn G+ bào tử hình thành ở giữa tế bào thành 1 hình tròn và không bắt màu thuốc nhuộm, ở hai đầu còn lại vẫn bắt màu tím do vẫn có peptidoglycan dày.
Xác định hình thái khuẩn lạc: Dựa vào hình thái khuẩn lạc đặc trƣng để xác định hình thái khuẩn lạc của chủng vi sinh vật nghiên cứu.
Phương pháp xác định hoạt tính catalase
Nguyên tắc: Catalase xúc tác phản ứng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và giải phóng các phân tử oxy (có hiện tƣợng sủi bọt). Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí đều có catalase giúp loại trừ sự tích tụ chất độc hại đối với tế bào là H2O2 đƣợc tạo ra trong chuỗi hô hấp.
Cách tiến hành:
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên khuẩn lạc, hoặc chuyển một lƣợng vi sinh vật lên lam kính rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%. Dựa vào hiện tượng sủi bọt thì phản ứng dương tính (+) còn không sủi bọt thì phản ứng âm tính (-) về hoạt tính catalase của chủng vi sinh vật.
Phản ứng Voges - Proskaeur (VP) Nguyên tắc:
- Phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hóa 2,3-butanediol thành acetoin khi có O2 và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl.
- Diacetyl kết hợp với guanidine trong peptone tạo thành phức diacetyl- guanidin có màu đỏ.
Cách tiến hành:
- Sử dụng môi trường MR - VP Broth
- Khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút, để nguội.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 4 - 5 ml môi trường.
- Bổ sung 0,1 ml dịch vi khuẩn vào mỗi ống, có ống đối chứng không cấy vi khuẩn.
- Nuôi lắc ở 370C trong 24 - 48 giờ.
- Nhỏ 3 - 5 giọt NaOH 40% và 3 - 5 giọt α - Naphtol 10%, lắc nhẹ.
- Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ. Phản ứng dương tính (+) có màu đỏ, âm tính (-) màu vàng.
2.4.3.2. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử
Mục đích: Dựa vào kết quả định danh bằng sinh học phân tử có thể khẳng định đƣợc chủng vi sinh vật nghiên cứu thuộc loài nào và độ an toàn khi sử dụng trong quá trình nghiên cứu nhằm thu hồi đƣợc hàm lƣợng PGA tốt nhất với độ an toàn cao nhất.
2.4.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số Nguyên tắc:
Để tách chiết đƣợc DNA cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên kết của protein với DNA. Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA. Các thao tác thực hiện phải tuyệt đối vô trùng.
Tiến hành:
Bước 1: Nuôi tăng sinh chủng TN5 trong 24 giờ ở 37oC, 140 v/p.
Bước 2: Tách thu sinh khối bằng li tâm 10.000 rpm trong 5 phút.
Bước 3: Pellet hũa với 567 àl đệm TE, thờm 30 àl SDS 10%, và cuối cựng cho 3 àl ProteaseK 20mg/ml vào và lắc ổn nhiệt ở 37°C trong 1 giờ.
Bước 4: Bổ sung 100 àl NaCl 5M vào, cho tiếp 80 àl CTAB/NaCl vào và ủ 10 phút ở 65°C
Bước 5: Bổ sung 700 àl dung dịch CI (Chloroform: isoamyl alcohol) (25:24:1) trộn đều, li tâm 5 phút ở 10.000rpm.
Bước 6: Tách lấy phần lỏng bên trên, cho vào effedolf mới và cho một lƣợng CI bằng với thể tích dịch lỏng thu đƣợc, li tâm tiếp 5 phút ở 10.000rpm.
Bước 7: Thu phần lỏng bên trên cho sang ống effendolf mới, bổ sung 0,6 phần thể tích isopropanol lạnh để kết tủa DNA, đợi kết tủa hết thì li tâm 5 phút ở 10.000rpm.
Bước 8: Thờm 500 àl ethanol 70% (lạnh). Li tõm 10 phỳt rồi loại hết ethanol bằng micropipette và để khô hoàn toàn phần pellet thu đƣợc.
Bước 9: Thờm 50 àl đệm TE rồi bảo quản ở -20oC.
2.4.3.2.1. Phương pháp điện di gel agarose
Bước 1: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45 - 50oC rồi đổ vào khuôn gel đã đƣợc chuẩn bị sẵn. Sau 20-30 phút, gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào bể điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm.
Bước 2: Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng trên gel.
Bước 3: Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn với chế độ chạy 100V và 90mA.
Bước 4: Nhuộm gel: Bản gel sau khi chạy điện di xong được nhuộm trong dung dịch EtBr 0,5g/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nước trước khi soi gel.
Bước 5: Quan sát: Gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr.
2.4.3.2.3. Phản ứng PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên thế giới.
Tiến hành
Thành phần của phản ứng PCR chuẩn với thể tớch phản ứng 100àl là:
- DNA khuôn (105 – 106 phân tử)
- 50pmol mỗi mồi - 200àmol mỗi dNTP - 2U Taq polymerase - 1,5 mM MgCl2
- 50mM KCl, 10mM Tris HCl (pH 8.4) - Nước deion
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chuẩn:
- Biến tính ở chu kỳ đầu ở 94oC trong 5 phút. Các chu kỳ sau biến tính trong 1 phút
- Bắt cặp mồi ở nhiệt độ khoảng 50 – 60oC trong 30 giây - Kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút
- Trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc nhƣ sau:
+ Mồi xuôi: 16SF: 5’-CGGAATTCATTGCTGGACCTG-3’
+ Mồi ngƣợc: 16SR: 5’-GTCCTAGAGCTTTGTCTTTAGG-3’
Thực hiện 25 – 40 chu kỳ. Chu kỳ cuối thực hiện ở 72oC trong 5 phút.
Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 4oC.
2.4.3.2.4. Giải trình tự
Sản phẩm PCR 16s rRNA sau khi tinh sạch đƣợc tiến hành gửi đi giải trình tự hai chiều theo phương pháp Sanger cải tiến. Trình tự hai chiều được phân tích bằng chương trình http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html và phần mềm BioEdit tại Singapo.