3.4.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp PGA
pH môi trường nuôi cấy là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp PGA của chủng vi sinh vật. Theo một số các công trình nghiên cứu đã công bố trước, điều kiện sinh tổng hợp γ-PGA tốt nhất ở khoảng pH 6 – 7,5. Khảo sát sự thay đổi pH trong khoảng 6 – 9, chủng vi sinh vật B. subtillis TN5 được tăng sinh trên môi trường LB, sau đó tiến hành cấp giống 3% (v/v) sang môi trường E. Lên men ở 35oC, chế độ nuôi tĩnh, lấy mẫu tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, ly tâm loại sinh khối và tiến hành xác định hàm lƣợng PGA. Kết quả đƣợc thể hiện ở biểu đồ:
Hình 3.7. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh PGA của chủng B.subtillis TN5
pH có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh PGA của chủng vi sinh vật B.
subtillis TN5. Ở giá trị pH = 9, nồng độ PGA rất thấp và có biến động không nhiều (cao nhất ở 96 giờ với hàm lƣợng 4,6 mg/ml – 4,5g/l). Hàm lƣợng PGA đạt giá trị cao nhất là 13,23 g/l tại pH = 7, sau đó là pH8 và pH6. So với báo cáo của Wu Qun và cs (2010), pH tối ƣu cho quá trình tổng hợp PGA là 6,5.
Điều này khẳng định đặc tính và khả năng thích ứng của mỗi chủng là khác nhau. Do các chủng đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau và điều kiện sinh
8.71
13.23
10.20
4.60
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
pH=6 pH=7 pH=8 pH=9
Nồng độ PGA (mg/ml)
pH
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
thái môi trường ở mỗi vùng có sự thay đổi lớn. Vì vậy lựa chọn pH = 7 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy
Thời gian lên men là một trong những yếu tố quan trọng để xác định đƣợc thời điểm thu hồi PGA tốt nhất. Xác định đƣợc thời gian chủng B.
subtillis TN5 có khả năng tạo ra hàm lƣợng PGA cao nhất trong khoảng thời gian ngắn có thể xác định đƣợc thời gian thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Chủng B. subtillis TN5 được tăng sinh trên môi trường LB, sau đó tiến hành cấp giống 3% sang môi trường E. Lên men ở 35oC, chế độ nuôi tĩnh, lấy mẫu tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 và 120 giờ. Ly tâm loại sinh khối và tiến hành xác định hàm lƣợng PGA. Kết quả đƣợc thể hiện ở biểu đồ:
Hình 3.8. Khảo sát thời gian nuôi cấy chủng B. subtillis TN5
Qua kết quả cho thấy, trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 96 giờ hàm lƣợng PGA tăng mạnh và đạt cực đại tại 96 giờ với hàm lƣợng 13,23 mg/ml.
Qua 96 giờ, hàm lƣợng PGA có tăng nhƣng không đáng kể (từ 13,23 tăng lên 13,46 mg/ml). Do đó lựa chọn mốc thời gian 96 giờ là thời gian thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.53
7.06
10.54
13.23 13.46
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
Nồng độ PGA (mg/ml)
Thời gian
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng – Natri glutamate
Nồng độ chất cảm ứng là nguồn cơ chất cảm ứng hệ gen vi sinh vật tổng hợp ra các hợp chất mong muốn. Chất cảm ứng đƣợc sử dụng trong quá trình tổng hợp PGA là natri glutamate đƣợc thay đổi nồng độ 0; 1; 2; 3 % (w/w). Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng có những loài vi sinh vật không cần bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng vẫn có khả năng tổng hợp PGA. Tuy nhiên, phần lớn trong các nghiên cứu đều phải bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng. Hàm lượng chất cảm ứng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nên các chất cần thiết, khi quá ít thì quá trình tổng hợp các chất mong muốn sẽ suy giảm, ngƣợc lại quá nhiều sẽ ức chế quá trình tổng hợp.
Chủng TN5 sau khi được tăng sinh trên môi trường LB trong 24 giờ, lắc 140 v/p, tiến hành cấp giống 3%(v/v) sang môi trường lên men. Quá trình lên men đƣợc nuôi ở 35oC, pH 7, nuôi tĩnh, lấy mẫu tại thời điểm 96 giờ và tiến hành xác định hàm lƣợng PGA.
Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh PGA Kết quả cho thấy chất cảm ứng có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng PGA đƣợc sinh ra. Ở nồng độ 0% (w/v) hàm lƣợng PGA đạt thấp nhất là 4,60 mg/ml và tăng dần ở các nồng độ tiếp theo. Hàm lƣợng PGA cao nhất đạt 20,70mg/ml (tương ứng 20,7 g/l) tại nồng độ 2,5% (w/v). Lượng PGA tạo thành có xu hướng giảm dần khi nồng độ cơ chất tăng lên. Kết quả này
4.60
10.57
12.60
20.70
14.22
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
0% 1% 2% 2.5% 3%
cũng trùng hợp với nghiên cứu của Cromwick và cs (1996). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung 20 – 30 g/l acid glutamic vào canh trường lên men là phù hợp để sinh tổng hợp PGA.
3.4.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống
Tỉ lệ cấp giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men. Tỉ lệ cấp giống quá cao hay quá thấp đều có ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men. Khi tỉ lệ cấp giống quá thấp, tỉ lệ vi sinh vật ban đầu ít, tăng thời gian lên men có khả năng nhiễm tạp gây nên hiệu quả không cao. Ngƣợc lại khi tỉ lệ cấp giống quá cao, tỉ lệ vi khuẩn ban đầu nhiều, khả năng tiêu thụ chất cảm ứng lớn gây nên sự ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Chủng TN5 đƣợc tăng sinh và cấp giống sang môi trường E với các tỉ lệ: 1%, 3%, 5%, 10% (v/v), lấy mẫu tại thời điểm 96 giờ và tiến hành xác định hàm lƣợng PGA. Kết quả thu đƣợc thể hiện qua biểu đồ dưới đây:
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến khả năng sinh PGA của chủng B. subtilis TN5
Nghiên cứu với các tỷ lệ cấp giống đến quá trình hình thành γ-PGA dao động trong khoảng 1% đến 10% với thời gian lên men là 96 giờ cho thấy:
lƣợng cấp giống ở tỉ lệ 5% cho hàm lƣợng PGA cao nhất đạt 22,52 mg/ml (tương ứng 22,5 g/l). Tại tỉ lệ cấp giống 1 và 10% khả năng sinh tổng hợp
13.23
20.85
22.52
10.20
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
1% 3% 5% 10%
Chart Title
PGA giảm, chỉ đạt 10,2 mg/ml tại nồng độ 10% và 13,2 mg/ml tại nồng độ 1%. Như vậy tỉ lệ cấp giống cao quá hay ít quá đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp, bởi nếu ít quá vi khuẩn cần phải có thời gian sinh trưởng và phát triển, khi đó sự hình thành γ-PGA cần phải kéo dài hơn, đối với tỷ lệ cấp giống cao dẫn tới sự cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng trong giai đoạn sinh trưởng, gây sự mất cân bằng trong canh trường dẫn đến sự hình thành các sản phẩm phụ, thay đổi môi trường pH, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh γ-PGA. Qua đó, lựa chọn tỉ lệ cấp giống là 5% cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ
C, H, N, O là những nguyên tố khoáng đa lƣợng không thể thiếu để cấu thành nên tế bào vi sinh vật. Trong đó, nitơ là nguồn dinh dƣỡng không thể thiếu đối với các cơ thể sống để có thể tổng hợp nên các thành phần tế bào quan trọng nhƣ protein, acid nucleic, enzyme… Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến khả năng tổng hợp PGA của chủng B. subtillis TN5 cũng rất quan trọng.
Với mục đích lựa chọn đƣợc nồng độ nitơ thích hợp để thu đƣợc PGA với nồng độ cao và chi phí thấp.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl đến khả năng sinh PGA của chủng B. subtilis TN5
20.70
22.73
26.91
24.31
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
0.4% 0.7% 1.1% 1.5%
Nồng độ PGA (mg/ml)
Tỉ lệ NH4Cl
Qua nghiên cứu trên nhận thấy hàm lƣợng PGA đƣợc tổng hợp trên môi trường E với tỷ lệ nitơ khác nhau thay đổi khá lớn. Ở tỉ lệ NH4Cl 1,1%
đạt giá trị PGA cao nhất là 26,91 mg/ml (26,91 g/l). Nhƣ vậy, lựa chọn nồng độ Nitơ là 1,1% (11g/l) cho các nghiên cứu sau.