CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh màng nhầy (Polysacarit)
Cân 10 g mẫu đất vào các bình tam giác chứa 90 ml môi trường AT, nuôi cấy lắc trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày. Dung dịch thu được gọi là dịch làm giàu.
Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch làm giàu cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước muối sinh lý đã chuẩn bị sẵn, tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex để có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha loãng 10-5, 10-6.
Dùng một pipet vô trùng khác lấy 0,1 ml dung dịch mẫu pha loãng cấy vào đĩa Petri chứa môi trường AT đã chuẩn bị sẵn.
Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong thời gian từ 3 đến 5 ngày; quan sát và thu những khuẩn lạc có khả năng sinh màng nhầy trên bề mặt thạch.
Các khuẩn lạc sau khi phân lập được làm thuần bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch chứa môi trường AT. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.
Môi trường AT bao gồm: 20g CaCO3; 20g D-Glucose; 0,8g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,2g KH2PO4; 0,1 FeCl3. 6H2O; 0,05g Na2MoO4.2 H2O;
12 Agar; Nước cất 1000ml.
- Phương pháp tuyển chọn:
Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường Hansen lỏng, sau đó tuyển chọn VSV bằng việc xác định độ nhớt của dịch nuôi sau 5 ngày bằng nhớt kế Ostwald. Độ nhớt của dịch nuôi cấy được tính theo công thức:
ŋ = (ŋ1 x d x t)/(d1 x t1) (N.s/m2) ŋ: Độ nhớt của dịch nghiên cứu
ŋ1: Độ nhớt của nước ở 300C d1: Tỷ trọng của nước ở 300C d: Tỷ trọng của dịch nghiên cứu t: Thời gian chảy của dịch nghiên cứu t1: Thời gian chảy của nước
Từ thí nghiệm trên ta chọn được một số chủng vi sinh vật sinh màng nhầy có tác dụng tốt nhất.
Từ một số chủng VSV sinh màng nhầy đã tuyển chọn được tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ đến sinh trưởng.
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng.
Cấy VSV sinh màng nhầy vào chính giữa hộp lồng có chứa môi trường Asby hoặc môi trường chuyên dụng xếp các hộp lồng này vào tủ định ôn có thang nhiệt độ khác nhau 50C± 1; 100C± 1 ; 150C± 1; 200C±1; 250C ± 1; 300C
±1; 350C ±1, 400C± 1 mỗi thang nhiệt độ 10 hộp theo dõi trong 10 ngày cứ 24 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình).
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
- Phương pháp đánh giá một số chủng vi sinh vật sinh màng nhầy tồn tại ở trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau.
Phương pháp được tiến hành theo Borth.C pha NaCl với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo ra môi trường không khí có độ ẩm không khí (RH%) khác nhau cụ thể như sau:
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
NaCl(g/1lit) 0 16 32 64 80
RH % 100 90 80 70 60
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn mỗi bình 1 lít nước, đậy nắp để trong tối có nhiệt độ 280C, 48 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình). Thí nghiệm theo dõi và thu số liệu trong vòng 10 ngày. Cấy nấm vào chính giữa hộp lồng có chứa môi trường chuyên dụng, mỗi bình đặt 10 hộp lồng sau 48 giờ đo đường kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính khuẩn lạc trung bình làm đại diện cho thí nghiệm.
Từ thí nghiệm này chọn được 10 chủng có dải nhiệt độ và ẩm độ lớn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
- Đánh giá vi sinh vật sinh màng nhầy đối với vật liệu cháy ở rừng thông (trong bình thí nghiệm)
Từ một số chủng VSV sinh màng nhầy đã chọn tiến hành nhân sinh khối và thử nghiệm xác định khả năng giữ ẩm tự nhiên: Thí nghiệm được tiến hành với các công thức mỗi công thức 10 bình 3 lần lặp. Thí nghiệm cụ thể như sau: Vật liệu cháy ở rừng thông sau khi thu thập cắt nhỏ, phơi khô. Cân 200 g cho vào bình tam giác 1000ml. Sau đó bổ sung vào mỗi bình 40ml dịch nuôi cấy lắc vi sinh vật, bình đối chứng bổ sung nước cất. Theo dõi bình ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 60 ngày. Sau đó tính độ ẩm của vật liệu cháy theo công thức:
Độ ẩm của vật liệu cháy được xác định bằng công thức sau:
W = (m1-m2)/m2 x 100
Trong đó: W - độ ẩm tuyệt đối của vật liệu cháy dưới tán rừng m1 - trọng lượng của vật liệu cháy trước khi sấy (g) m2 - trọng lượng của vật liệu cháy đã sấy khô kiệt (g)
Từ thí nghiệm này chọn ra một số chủng VSV có khả năng sinh chất giữ ẩm cao đối với vật liệu cháy cao nhất.
- Đánh giá vi sinh vật sinh màng nhầy trong chậu vại đối với vật liệu cháy Từ các chủng VSV có khả năng sinh màng nhầy đối với vật liệu cháy tốt ở trên tiếp tục thí nghiệm trên quy mô chậu vại sau đó nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường lỏng phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định khả năng tăng giữ ẩm của một số chủng VSV trên. Mỗi chủng VSV được thí nghiệm với 3 thùng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và 1 công thức đối chứng. Cân trọng lượng 10 kg vật liệu cháy mỗi loại cho vào thùng thí nghiệm. Bổ sung vào mỗi thùng thi nghiệm 200 ml dịch sinh khối riêng rẽ của từng chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo. Công thức 5: đối chứng bổ sung 200 ml nước cất.
Đặt thùng thí nghiệm ở nơi thoáng, tránh mưa, gió. Sau 60 ngày, so sánh độ ẩm vật liệu với công thức đối chứng. Thí nghiệm này sẽ chọn được 2-3 chủng VSV sinh màng nhầy có hiệu lực tốt nhất để sản xuất chế phẩm.
2.3.2. Phương pháp định danh đến loài một số chủng vi sinh vật có hoạt tính cao được tuyển chọn.
Từ các kết quả ở trên chọn một số chủng VSV sinh màng nhầy tốt nhất giám định tên VSV bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16S hoặc 28S ARN riboxom của các chủng VSV nghiên cứu, so sánh các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng VSV được xác định với hệ số tương đồng cao nhất.
Phương pháp định danh vi khuẩn
Tách chiết ADN: Vi khuẩn sinh màng nhầy được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp. Lấy 1 vòng que cấy tế bào vào ống eppendorf vô trùng, thờm 500 àl 2ìSSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 990C trong 10 phỳt. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vụ trựng. Thờm khoảng 100 àl hạt thủy tinh cú đường kớnh
0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 àl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 àl nước cất vụ trựng. Lắc ở 1400 vũng/phỳt trong 10 phỳt trờn mỏy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -200C.
Định tên vi khuẩn bằng giải trình tự nucleotide: Phân đoạn 16S rADN của vi khuẩn được phản ứng trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng cặp mồi 16S-8F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16S1510R (5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’). Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 940C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (940C trong 30 giây, 520C trong 30 giây và 720C trong 1 phút). Quá trình phản ứng được hoàn tất ở 720C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 100C. Sản phẩm PCR sau khi phản ứng được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng.
Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1994). Cây tiến hóa được hiển thị bằng phần mềm TreeExplorer.
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học
2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh.
- Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy phù hợp: Thí nghiệm được thực hiện với 3 loại môi trường khác nhau (môi trường PD, AT và King
B) với tốc độ lắc (150 vòng/phút), nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ, bình tam giác 500 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Phương pháp xác định tốc độ lắc phù hợp: Được thực hiện với 5 công thức ở các tốc độ lắc khác nhau (0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút) mỗi tốc độ lắc 10 bình tam giác 500 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VSV vào các bình lắc ở các tốc độ khác nhau, nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ.
- Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp: Được thực hiện với 5 công thức ở các thời gian nuôi cấy khác nhau (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) mỗi công thức 10 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VSV như nhau sau lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 280C.
- Phương pháp xác định nhiệt độ nhân sinh khối phù hợp: Được tiến hành với 8 công thức ở các thang nhiệt độ khác nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C) mỗi thí nghiệm 10 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. VSV vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Đếm số lượng khuẩn lạc ở các công thức khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
- Phương pháp xác định pH nhân sinh khối phù hợp: Được tiến hành với 6 dải pH cụ thể như sau: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 mỗi thí nghiệm 3 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. VSV vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998).
2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng tập hợp các chủng VSV
Sử dụng phương pháp cấy vạch để đánh giá mối quan hệ các chủng vi sinh vật được lựa chọn, xem chúng có đối kháng nhau hay không ? Các chủng VSV được cấy thành các đường thẳng vuông góc, mỗi chủng đều cắt nhau tại
nhiều điểm. Nuôi cấy ở 280C trong vòng 24 đến 48 giờ. Từ thí nghiệm này chọn được 1-2 chủng VSV có khả năng phân hủy tốt với VLC dưới tán rừng thông.
2.3.3.3. Phương pháp nghiên cứu sản xuất chế phẩm
- Một số chất mang được đưa vào thử nghiệm như chất mùn hữu cơ/than bùn/tinh bột sắn/apatit… được thử nghiệm để sản xuất chế phẩm.
Thành phần và tỷ lệ phối trộn các chất mang của chế phẩm được thực hiện theo 5 công thức (mật độ VSV 107 CFU/gam chế phẩm).
Công thức 1: 90% Mùn hữu cơ + 10% VSV sinh màng nhầy.
Công thức 2: 90% Than mùn + 10% VSV sinh màng nhầy.
Công thức 3: 80% Mùn hữu cơ + 10% apatits + 10% VSV sinh màng nhầy Công thức 4: 70% Mùn hữu cơ + 20% apatits + 10% VSV sinh màng nhầy.
Công thức 5: 60% Mùn hữu cơ + 30% apatits + 10% VSV sinh màng nhầy.
Công thức 6: 50% Mùn hữu cơ + 40% apatits + 10% VSV sinh màng nhầy Thời gian bảo quản chế phẩm trong vòng 6 tháng, mỗi tháng tiến hành kiểm tra mật độ một lần.
- Các chủng được nhân riêng rẽ trên môi trường thạch đĩa hoặc môi trường AT lỏng rồi đem nuôi ở tủ định ôn có nhiệt độ phù hợp trong 3-5 ngày.
Sau đó đem nhân tiếp trên môi trường AT lỏng trong vòng 72 giờ rồi trộn với chất mang.
2.3.3.4. Xây dựng hướng dẫn sản xuất chế phẩm sinh học
Hướng dẫn sản xuất chế phẩm sinh học được tập hợp từ kết quả nghiên cứu các thông số kỹ thuật.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học 2.3.4.1. Nghiên cứu thời gian sử dụng chế phẩm sinh học
Tại 2 khu vực đại diện (Hoành Bồ, Quảng Ninh và Sóc Sơn, Hà Nội) Thời gian sử dụng chế phẩm sinh học được thực hiện với 4 công thức cụ thể như sau:
CT1: Xử lý chế phẩm vào thời gian từ tháng 1 dương lịch
CT2: Xử lý chế phẩm vào thời gian từ tháng 4 dương lịch CT3: Xử lý chế phẩm vào thời gian từ tháng 7 dương lịch CT4: Xử lý chế phẩm vào thời gian từ tháng 10 dương lịch CT5: Đối chứng không sử dụng chế phẩm
Tổng số đống ủ = 4 lần x 2 địa điểm (Hoành Bồ Quảng Ninh và Sóc Sơn, Hà Nội) x 3 lần lặp = 24 đống ủ.
Thí nghiệm được theo dõi và đánh giá khả năng sinh màng nhầy 2.3.4.2. Xác định liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học
- Liều lượng sử dụng chế phẩm sinh học được thực hiện tại Sóc Sơn, Hà Nội hoặc Hoành Bồ Quảng Ninh với 5 công thức mỗi công thức 500 kg vật liệu cháy được ủ đống mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Công thức 1: Sử dụng 0,125% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 2: Sử dụng 0,25% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 3: Sử dụng 0,5% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 4: Sử dụng 1,0% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 5: Sử dụng 1,5% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 6: Sử dụng 2,0% khối lượng chế phẩm so với khối lượng VLC Công thức 7: Đối chứng không sử dụng chế phẩm
2.3.4.3. Nghiên cứu phương thức sử dụng chế phẩm sinh học tại chỗ
Từ thí nghiệm trên chọn ra công thức có khối lượng sử dụng chế phẩm tốt nhất. Tại Sóc Sơn Hà Nội/Hoành Bồ Quảng Ninh Phương thức sử dụng chế phẩm sinh học tại chỗ đối với những khu vực có độ dầy vật liệu lớn. Tiến hành lập ô tiêu chuẩn xử lý chế phẩm 100m2 (10x10m) theo diện tích và theo đường băng cản lửa thí nghiệm được thực hiện với 2 hình thức như sau (hoạt hóa bằng vôi bột trước khi xử lý chế phẩm và không hoạt hóa bằng vôi bột).
Thí nghiệm được tiến hành với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần lặp. Các công thức cụ thể như sau:
Công thức 1: Sử dụng chế phẩm sinh học rắc toàn diện theo đường băng cản lửa (100% diện tích) của đường băng chính hoặc đường băng phụ trong quy định phòng chống cháy rừng thông.
Công thức 2: Sử dụng chế phẩm sinh học rắc cục bộ theo đường đồng mức (chiều rộng của đường đồng mức 10m) với 75% diện tích có nghĩa rắc 3 đường đồng mức liên tiếp thì bỏ lại 1 đường.
Công thức 3: Sử dụng chế phẩm sinh học rắc cục bộ theo đường đồng mức (chiều rộng của đường đồng mức 10m) với 50% diện tích có nghĩa rắc 1 đường đồng mức thì bỏ lại 1 đường không rắc.
Công thức 4: Sử dụng chế phẩm sinh học rắc cục bộ theo đường đồng mức (chiều rộng của đường đồng mức 10m) với 25% diện tích có nghĩa rắc 1 đường đồng mức thì bỏ lại 3 đường không rắc.
Công thức 5: Đối chứng không có chế phẩm
Tổng số OTC: 5 công thức x 2 phương thức (có rắc vôi và không rắc vôi) x 3 lần lặp x 1 loại chế phẩm = 30 OTC.
Tổng diện tích: 30 OTC x 100m2/ô = 3000 m2
Tổng số OTC: 5 công thức x 2 phương thức (có rắc vôi và không rắc vôi) x 3 lần lặp x 1 loại chế phẩm = 30 OTC.
Tổng diện tích: 30 OTC x 100m2/ô = 3000 m2
2.3.4.4. Xác định phương thức sử dụng chế phẩm cho vật liệu cháy đã được thu gom Phương thức sử dụng chế phẩm sinh học bằng phương pháp gom vật liêu cháy theo đường băng cản lửa/gom theo đường đồng mức, gom VLC theo đống thí nghiệm được thực hiện với 2 hình thức như sau (hoạt hóa bằng vôi bột trước khi xử lý chế phẩm và không hoạt hóa bằng vôi bột) với 5 công thức, mỗi công thức lập 1 OTC mỗi ô 100m2 (10x10m) 3 lần lặp. Các công thức cụ thể như sau:
Công thức 1: Gom toàn bộ VLC ở đường băng cản lửa/diện tích rừng
Công thức 2: Gom 75% diện tích có nghĩa gom 3 đường đồng mức liên tiếp thì bỏ lại 1 đường.
Công thức 3: Gom 50% diện tích có nghĩa gom 1 đường bỏ lại 1 đường Công thức 4: Gom 25% diện tích có nghĩa gom 1 đường bỏ lại 3 đường Công thức 5: Đối chứng không có chế phẩm
Tổng số OTC: 5 công thức x 2 phương thức (có rắc vôi và không rắc vôi) x 1 chế phẩm x 3 lần lặp =30 OTC.
Tổng diện tích: 30 OTC x 100m2/ô = 3000 m2 = 0,3 ha.
Theo dõi thí nghiệm để đánh giá khả năng theo phương pháp giữ ẩm VLC của (Bế Minh Châu, 2001).