CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh màng nhầy (Polysacarit)
3.1.1. Phân lập vi sinh vật sinh màng nhầy
Phân lập các chủng vi sinh vật sinh mành nhầy từ 75 mẫu đất, mùn dưới tán rừng thông ở 4 khu vực nghiên cứu: Hoành Bồ - Quảng Ninh; Sóc Sơn - Hà Nội; Tĩnh Gia - Thanh Hóa; Lộc Bình – Lạng Sơn: Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Số lượng vi sinh vật sinh màng nhầy phân lập được ở các khu vực nghiên cứu
STT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu chủng VSV phân lập đươc
1 LS1 Lộc Bình - Lạng Sơn _
2 LS2 Lộc Bình - Lạng Sơn _
3 LS3 Lộc Bình - Lạng Sơn P03
4 LS4 Lộc Bình - Lạng Sơn _
5 LS5 Lộc Bình - Lạng Sơn _
6 LS6 Lộc Bình - Lạng Sơn _
7 LS7 Lộc Bình - Lạng Sơn _
8 LS8 Lộc Bình - Lạng Sơn P08; P08.1
9 LS9 Lộc Bình - Lạng Sơn P09
10 LS10 Lộc Bình - Lạng Sơn _
11 LS11 Lộc Bình - Lạng Sơn _
12 LS12 Lộc Bình - Lạng Sơn _
13 LS13 Lộc Bình - Lạng Sơn _
14 LS14 Lộc Bình - Lạng Sơn _
15 LS15 Lộc Bình - Lạng Sơn _
16 LS16 Lộc Bình - Lạng Sơn P16; P16.1
17 SS17 Sóc Sơn - Hà Nội _
18 SS18 Sóc Sơn - Hà Nội _
19 SS19 Sóc Sơn - Hà Nội _
20 SS20 Sóc Sơn - Hà Nội _
STT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu chủng VSV phân lập đươc
21 SS21 Sóc Sơn - Hà Nội _
22 SS22 Sóc Sơn - Hà Nội _
23 SS23 Sóc Sơn - Hà Nội _
24 SS24 Sóc Sơn - Hà Nội _
25 SS25 Sóc Sơn - Hà Nội _
26 SS26 Sóc Sơn - Hà Nội _
27 SS27 Sóc Sơn - Hà Nội _
28 SS28 Sóc Sơn - Hà Nội _
29 SS29 Sóc Sơn - Hà Nội _
30 SS30 Sóc Sơn - Hà Nội _
31 SS31 Sóc Sơn - Hà Nội _
32 SS32 Sóc Sơn - Hà Nội _
33 SS33 Sóc Sơn - Hà Nội _
34 SS34 Sóc Sơn - Hà Nội _
35 SS35 Sóc Sơn - Hà Nội -
36 SS36 Sóc Sơn - Hà Nội P36
37 SS17 Sóc Sơn - Hà Nội P37
38 SS18 Sóc Sơn - Hà Nội _
39 HB39 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
40 HB40 Hoành Bồ - Quảng Ninh P40
41 HB41 Hoành Bồ - Quảng Ninh P41
42 HB42 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
43 HB43 Hoành Bồ - Quảng Ninh P43
44 HB44 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
45 HB45 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
46 HB46 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
47 HB47 Hoành Bồ - Quảng Ninh P47
48 HB48 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
49 HB49 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
50 HB50 Hoành Bồ - Quảng Ninh _
51 HB51 Hoành Bồ - Quảng Ninh P51
52 HB52 Hoành Bồ - Quảng Ninh P52
53 HB53 Hoành Bồ - Quảng Ninh -
STT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu chủng VSV phân lập đươc
54 HB54 Hoành Bồ - Quảng Ninh P54; P54.1
55 HB55 Hoành Bồ - Quảng Ninh P55
56 HB56 Hoành Bồ - Quảng Ninh P56
57 HB57 Hoành Bồ - Quảng Ninh -
58 HB58 Hoành Bồ - Quảng Ninh P58; P58.1
59 TG59 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P59; P60
60 TG60 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
61 TG61 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P61
62 TG62 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P62
63 TG63 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P63
64 TG64 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
65 TG65 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P65
66 TG66 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
67 TG67 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
68 TG68 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P68
69 TG69 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P69
70 TG70 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
71 TG71 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P71
72 TG72 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
73 TG73 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P73; P73.1
74 TG74 Tĩnh Gia - Thanh Hóa -
75 TG75 Tĩnh Gia - Thanh Hóa P75
(Nguồn: Số liệu nghiên cứu) Qua số liệu Bảng 3.1 cho thấy từ 75 mẫu đất và mùn đã tiến hành phân lập được 32 chủng vi sinh vật sinh màng nhầy. Số lượng các chủng ở các khu vực khác nhau là khác nhau. Ở Lộc Bình Lạng Sơn số lượng VSV sinh màng nhầy phân lập được 6 chủng chiếm 18,75%; Ở Sóc Sơn Hà Nội số lượng VSV sinh màng nhầy phân lập được ít nhất (2 chủng) chiếm 6,25%; Ở Hoành Bồ Quảng Ninh số lượng VSV sinh màng nhầy phân lập được nhiều nhất (12 chủng) chiếm tỷ lệ 37,5%. Ở Tĩnh Gia Thanh Hóa số lượng VSV sinh màng nhầy phân lập được (10 chủng) chiếm tỷ lệ 31,25%.
Chủng P.16 Chủng P.51 Chủng P.09
Chủng P41 Chủng P37 Chủng P54.1
Chủng P55 Chủng P59 Chủng P58.1
Hình 3.1: Một số chủng Vi sinh vật sinh màng nhầy phân lập được 3.1.2. Kết quả đánh giá, tuyển chọn vi sinh vật sinh màng nhầy
Từ 32 chủng vi sinh vật phân lập được tiến hành tuyển chọn độ nhớt và hàm lượng polysaccarit khô. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.2.
vật phân lập được
STT Ký hiệu
chủng VSV Độ nhớt (10-3Ns/m2)
Hàm lượng polysaccarit tạo thành
(g khô/lít)
1 P03 11,56 12,1
2 P08 15,72 17,2
3 P8.1 12,42 13,7
4 P09 13,68 15,6
5 P16 2,54 3,2
6 P16.1 20,40 21,7
7 P36 11,67 13,5
8 P37 21,56 22,4
9 P40 16,68 17,2
10 P41 15,25 17,8
11 P43 15,97 17,6
12 P47 8,35 9,2
13 P51 20,6 21,4
14 P52 3,60 4,6
15 P54 7,31 9,8
16 P54.1 17,8 19,2
17 P55 10,43 12,5
18 P56 10,57 11,3
19 P58 15,23 17,5
20 P58.1 8,78 9,2
21 P59 11,45 13,5
22 P60 15,07 16,8
23 P61 6,85 7,7
24 P62 9,41 10,6
25 P63 12,89 14,2
26 P65 17,25 19,3
27 P68 7,46 8,3
28 P69 9,85 11,4
29 P71 10,98 12,7
30 P73 18,45 20,4
31 P73.1 6,50 7,9
32 P75 2,84 3,5
(Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp)
lượng polysaccarit tạo thành >15g khô/lít. Trong đó có 13 chủng (P08, P09, P16.1, P37, P40, P41, P43, P51, P54.1, P58, P60, P65, P73) có hàm lượng polysaccarit tạo thành >15g khô/lít.
Hình 3.2. Khả năng sinh polysaccarit của chủng P.16.1 và P.51
3.1.3. Kết quả nghiên cứu đánh giá một số chủng vi sinh vật sinh màng nhầy tồn tại ở trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV sinh màng nhầy
Sự phù hợp của nhiệt độ đến từng chủng vi khuẩn biều hiện ở khả năng sinh trưởng của chúng (mật độ khuẩn lạc hữu hiệu trên 1ml dung dịch nuôi cấy là lớn nhất). Ở mỗi loài vi khuẩn thì sự phù hợp với các nhiệt độ là khác nhau để đảm bảo được mật độ khuẩn lạc hữu hiệu tối ưu.Thí nghiệm được thực hiện trên 8 chế độ nhiệt độ khác nhau: 50C, 100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3.
100
kính khuẩn lạc vi khuẩn sinh màng nhầy
STT KH Mẫu
Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến đường kính khuẩn lạc (mm)
50C 100C 150C 200C 250C 300C 350C 400C 1 P08 1,2 4,2 7,0 29,0 32,6 34,0 31,0 22,6 2 P09 1,1 4,4 12,4 34,8 42,4 56,6 46,8 24,8 3 P16.1 2,3 6,4 24,2 34,4 37,0 36,8 30,2 14,8 4 P37 1,4 4,8 20,8 26,6 30,8 33,0 22,6 16,4 5 P40 1,2 6,2 41,0 50,2 60,2 54,8 40,8 32,2 6 P41 1,3 5,2 31,6 24,0 36,4 37,2 35,2 23,4 7 P43 2,1 8,0 52,6 59,2 76,8 49,4 35,6 33,2 8 P51 3,0 8,4 34,8 39,2 43,0 31,8 21,8 18,6 9 P54.1 1,5 3,8 34,6 57,4 59,6 56,6 45,0 36,4 10 P58 1,4 3,6 32,4 43,6 55,4 55,2 41,4 32,4
(Nguồn: Số liệu nghiên cứu) Qua bảng số liệu bảng 3.3 cho thấy các chủng vi sinh vật đều có thể tồn tại được trong khoảng nhiệt độ từ 5 đến 400C. Nhưng khi ở điều kiện nhiệt độ 50C các chủng VSV phát triển rất chậm, đường kính khuẩn lạc dao động từ 1,1- 3,0 mm. Khi ở điều kiện nhiệt độ 400C các chủng VSV phát triển kém. Khi thí nghiệm tăng nhiệt độ từ 10 đến 250C đường kính khuẩn lạc trên đĩa Petri cũng tăng lên. Đường kính khuẩn lạc của các chủng VSV đạt đường kính lớn nhất khi ở điều kiện nhiệt độ 25-300C.
5 oC 10oC 15 oC 20 oC
25 oC 30 oC 35 oC 40 oC
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của P16.1
3.1.4 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV sinh màng nhầy
Độ ẩm là một trong những nhân tố quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của VSV sinh màng nhầy. Kết quả về thí nghiệm về ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng của VSV sinh màng nhầy được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến đường sinh trưởng của VSV sinh màng nhầy
STT KH Mẫu Độ ẩm không khí (mm)
60% 70% 80% 90% 100%
1 P08 21,5 25,4 31,3 20,6 22,4
2 P09 9,5 18,3 18,5 15,5 7,1
3 P16.1 12,2 14,5 18,4 15,2 13,5
4 P37 8,0 18,7 18,5 18,6 7,5
5 P40 8,5 19,3 20,7 19,4 9,2
6 P41 9,0 17,5 19,5 17.5 6,5
7 P43 9,5 13,2 17,5 14.5 15
8 P51 7,5 18,5 19,5 19.7 7,8
9 P54.1 12,4 14,5 15,5 14,5 11,5
10 P58 7,5 10,5 11,25 10,6 8,5
(Nguồn: Số liệu nghiên cứu)
độ không khí trong khoảng từ 80% - 95%. Độ ẩm thích hợp nhất cho VSV phát triển là 90%. Ở độ ẩm không khí nhỏ hơn 80% và lớn hơn 95% VSV sinh màng nhầy phát triển bình thường (hình 3.4). Vậy chứng tỏ các chủng VSV sinh màng nhầy có khả năng sinh trưởng và thích nghi ở các độ ẩm khác nhau.
60% 70% 80%
90% 100%
Hình 3.4: Ảnh hưởng của ẩm độ đến đường kính khuẩn lạc chủng P16.1 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Từ thí nghiệm đã chọn được 10 chủng (P08, P09, P16.1; P37, P40, P41, P43, P51; P54.1, P58) có dải nhiệt độ và ẩm độ lớn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
- Đánh giá vi sinh vật sinh màng nhầy đối với vật liệu cháy ở rừng thông (trong bình thí nghiệm).
10 chủng (P08, P09, P16.1; P37, P40, P41, P43, P51; P54.1, P58) được đưa vào nhân sinh khôi và thử nghiệm xác định khả năng giữ ẩm trong bình thí nghiệm.
các chủng vi sinh vật trong bình thí nghiệm
STT KH Mẫu
Độ ẩm tuyệt đối của VLC sau 20
ngày (%)
Độ ẩm tuyệt đối của VLC sau 40
ngày (%)
Độ ẩm tuyệt đối của VLC sau 60
ngày (%)
1 P08 23,1 25,5 28,4
2 P09 22,5 24,5 26,7
3 P16.1 23,2 25,8 28,7
4 P36 23,0 25,6 28,6
5 P37 23,1 25,5 28,5
6 P40 23,0 25,4 27,9
7 P41 22,4 24,3 26,4
8 P43 23,0 25,6 28,3
9 P51 22,8 24,3 26,6
10 P54.1 22,6 24,4 26,5
11 P58 22,4 24,1 26,1
12 Đ/C 19,4 18,5 17,8
(Nguồn: Số liệu nghiên cứu) Qua số liệu bảng 3.5 cho thấy các chủng VSV sinh màng nhầy khác nhau có khả năng sinh chất giữ ẩm khác nhau. Ở giai đoạn 20 ngày độ ăm vật liệu cháy tăng từ 3,0 - 3,7% so với đối chứng. Ở thời điểm 40 ngày sau khi thí nghiệm độ ẩm vật liệu cháy khi xử lý tăng từ 5,6-7,3% và thời điểm 60 ngày độ ẩm tăng từ 8,3 - 10,9% trong đó có chủng P37 có khả năng sinh chất giữ ẩm tốt nhất.
Thí nghiệm chọn được 10 chủng VSV có khả năng sinh chất giữ ẩm cao nhất (P08, P09, P16.1, P36, P37, P40, P41, P43, P54.1, P51) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
nghiệm chậu vại.
Từ 10 chủng VSV có khả năng sinh màng nhầy đối với VLC tiếp tục thí nghiệm trên quy mô chậu vại với khối lượng VLC nhiều hơn (10kg VLC) kết quả được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá khả năng giữ ẩm của các chủng VSV sinh màng nhầy với vật liệu cháy trên quy mô chậu vại
STT KH Mẫu
Độ ẩm tuyệt đối của VLC (W%)
sau 20 ngày
Độ ẩm tuyệt đối của VLC (W%)
40 ngày
Độ ẩm tuyệt đối của VLC (W%)
60 ngày
1 P08 24,8 27,7 33,1
2 P09 24,9 27,8 32,5
3 P16.1 25,3 28,1 34,3
4 P36 25,0 27,9 33,0
5 P37 24,7 27,4 33,4
6 P40 25,0 27,5 32,0
7 P41 24,8 27,9 32,7
8 P43 24,7 27,6 32,5
9 P54.1 24,8 27,6 32,8
10 P51 24,9 27,8 32,9
11 Đ/C 19,5 18,4 18,0
(Nguồn: Số liệu nghiên cứu)
Qua số liệu bảng 3.6 cho thấy khả năng sinh chất giữ ẩm của các chủng VSV là rất khác nhau. Ở giai đoạn 20 ngày độ ẩm vật liệu cháy dao động rất ít giữa các công thức, độ ẩm ở các công thức khi xử lý dao động tăng từ 5,2 - 5,8%
so với đối chứng. Nhưng khi ở thời điểm 40 ngày thí nghiệm độ ẩm vật liệu cháy khi xử lý tăng từ 9,0-9,7% và thời điểm 60 ngày độ ẩm tăng lên rõ rệt 14,0 - 16,3% trong đó. Thí nghiệm chọn được 8 chủng VSV có khả năng sinh chất
chọn định danh và xác định mức độ an toàn sinh học và lựa chon để sản xuất chế phẩm.
3.1.5. Định danh đến loài và xác định mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao được tuyển chọn.
Đề tài định danh được 5 chủng VSV có hoạt tính sinh học cao và phù hợp với vật liệu cháy, kết quả được trình bảy ở Bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả định danh các chủng VSV sinh màng nhầy STT Tên mẫu Mã số trên
Genbank Độ tương đồng Định danh VSV 1 P16.1 MG937598.1 1417/1417 (100%) Bacillus megaterium 2 P08 MH938083.1 994/994 (100%) Bacillus aryabhattai
3 P40 CP001891.1 1404/1405
(99,93%) Klebsiella variicola
4 P43 CP001891.1 1404/1405
(99,93%) Klebsiella variicola
5 P37 CP001891.1 1404/1405
(99,93%) Klebsiella variicola (Nguồn: PGS.TS Vũ Nguyên Thành - Viện Công Nghệ Thực Phẩm)
Bảng kết quả 3.7 cho thấy các chủng được xác định tên với độ tương đồng rất cao, trong đó có tới 2 chủng có độ tương đồng lên đến 100%. Năm (5) chủng VSV sinh màng nhầy được định danh đều thuộc chi Bacillus trong đó chủng P6.1 (Bacillus megaterium) và P0.8 (Bacillus aryabhattai) và 3 chủng còn lại (P40; P43; P37 đều là loài Klebsiella variicola) với độ tương đồng 99,93%.
Xây dựng cây phả hệ
Hình 3.5: Vị trí phân loại của chủng P16.1 và chủng P08 với các loài có quan hệ họ hàng gần
Cây phân loại được xây dựng dựa trên trình tự ADN ribosome 16s của chủng Bacillus aryabhattai P08 và Bacillus megaterium P16.1 những loài đã biết thuộc chi Bacillus bằng việc sử dụng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Kimura 2-parameter. Việc so sánh được thực hiện theo 1000 lần gieo ngẫu
ứng 1% sự khác biệt.
Trình tự gen rARN 16S của chủng P08 tương đồng là 100% (994/994) với đoạn 16S của vi khuẩn Bacillus aryabhattai MH938083.1 (trình tự ADNr-16S trong phụ lục 2). Trình tự gen rARN 16S của chủng P16.1 tương đồng là 100%
(1404/1405) với đoạn 16S của vi khuẩn Bacillus megaterium MG937598.1 (trình tự ADNr-16S trong phụ lục 3).
Chủng P40; chủng P43 và chủng P37
Cây phân loại được xây dựng dựa trên trình tự ADN ribosome 16s của chủng Klebsiella variicola P40, Klebsiella variicola P43, Klebsiella variicola P37 và những loài đã biết thuộc chi Klebsiella bằng việc sử dụng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Kimura 2-parameter. Việc so sánh được thực hiện theo 1000 lần gieo ngẫu nhiên. Pseudomonas amygdali được sử dụng như nhóm ngoài. Thanh chèn tương ứng 2% sự khác biệt.
Trình tự gen rARN 16S của chủng P40; P43; P37 tương đồng là 99,93%
(1404/1405) với đoạn 16S của vi khuẩn Klebsiella variicola CP001891.1 (trình tự ADNr-16S trong phụ lục 4).
3.2.1 Kết quả nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV sinh màng nhầy Polysacarit sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (môi trường, tốc độ lắc, thời gian, nhiệt độ, độ pH)
Xác định môi trường nuôi cấy
Thí nghiệm được thực hiện với 3 loại môi trường lỏng (PD; AT; King B) với tốc độ lắc (150 vòng/phút), nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ kết quả được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến mật độ tế bào của VSV sinh màng nhầy
TT Chủng VSV Mật độ tế bào (cfu/ml)
PD AT King’B
1 P16.1 3,6.109 6,9.109 4,5.109
2 P08 3,4.109 6,7.109 4,2.109
3 P40 2,8.109 5,3.109 3,6.109
4 P43 2,7.109 5,4.109 3,4.109
5 P37 2,6.109 5,5.109 3,9.109
(Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp) Bảng kết quả 3.8 cho thấy mật độ tế bào của cả 5 chủng VSV sinh màng nhầy trên môi trường AT đều cao hơn so với hai môi trường còn lại (PD và King’B).
Mật độ tế bào trên môi trường AT lỏng dao động từ 3,9.109-4,5.109 (cfu/ml);
mật độ tế bào trên môi trường King’B dao động từ 6,5.108 – 2,9.109(cfu/ml) trong khi đó trên môi trường PD mật độ đạt từ 2,6.109 - 3,6.109 (cfu/ml). Từ kết quả thí nghiệm này có thể thấy môi trường AT phù hợp để nhân sinh khối VSV sinh màng nhầy.
Xác định tốc độ lắc sinh khối phù hợp
Kết quả thí nghiệm về tốc độ lắc ảnh hưởng đến mật độ tế bào VSV phân sinh màng nhầy được trình bày ở bảng 3.9.
VSV sinh màng nhầy
TT Chủng VSV
Mật độ tế bào hữu hiệu của các chủng VSV (cfu/ml) 0 vòng/phút 100
vòng/phút
150 vòng/phút
200 vòng/phút
1 P16.1 6,3.105 7,4.107 7,1.109 2,7.109
2 P08 6,7.105 6,8.107 6,8.109 2,9.109
3 P40 6,1.105 5,5.107 5,4.109 1,7.109
4 P43 6,8.105 6,1.107 5,5.109 2,8.109
5 P37 6,9.105 5,9.107 5,3.109 2,3.109
(Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp) Qua số liệu bảng 3.9 cho thấy mật độ tế bào của các chủng VSV sinh màng nhầy ở các tốc độ lắc khác nhau có sự biến động rất lớn. Ở tốc độ lắc 150 vòng/phút mật độ VSV sinh màng nhầy đạt 5,3-7,1.109 cfu/ml và cao hơn rất nhiều so với mật độ ở 3 tốc độ lắc còn lại. Trong khi đó mật độ để tĩnh chỉ đạt 6,1-6,9 cfu/ml.
Xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp
Kết quả thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối đến mật độ tế bào VSV sinh màng nhầy được trình bảy ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối đến mật độ tế bào
TT Chủng VSV
Mật độ tế bào của các chủng VSV (cfu/ml)
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 1 P16.1 2,5.103 6,5.105 6,7.109 6,7.108 3,8.107 2 P08 3,8.103 6,7.105 6,5.109 5,9.108 3,7.107 3 P40 3,8.103 5,8.105 5,3.109 6,7.108 4,7.107 4 P43 5,8.103 5,1.105 5,2.109 4,8.108 4,9.107 5 P37 3,4.103 5,6.105 5,0.109 4,3.108 3,3.107
(Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp)
màng nhầy tăng dần khi thời gian lắc tăng dần từ 24 giờ đến 48 giờ và đạt mật độ cao nhất khi 72 giờ lắc, mật độ biến động từ 5,0-6,7.109 cfu/ml). Tuy nhiên mật độ tế bào của các chủng VSV giảm nhẹ sau 96 giờ và sau 120 giờ lắc mật độ chỉ đạt 3,3 - 4,9.107 cfu/ml.
Xác định pH môi trường nhân sinh khối phù hợp
Kết quả thí nghiệm về ảnh hưởng của pH môi trường nhân sinh khối đến mật độ tế bào VSV sinh màng nhầy được trình bảy ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của pH môi trường đến mật độ tế bào
TT Chủng VSV
Mật độ tế bào của các chủng VSV (cfu/ml)
pH=4 pH=4,5 pH=5 pH=5,5 pH=6 pH=6,5 pH=7 1 P16.1 1,0.106 5,5.106 2,7.107 4,4.108 1,1.109 4,5.108 4,2.108 2 P08 3,2.106 7,4.106 1,1.108 1,5.109 4,1.108 3.108 8,2.107 3 P40 2,2.105 4,1.106 1,2.107 2,1.108 1.109 8,2.108 7,4.108 4 P43 4,7.106 7,1.106 1,8.107 1,5.109 8,7.108 4,8.108 4,2.108 5 P37 1,8.106 2,2.107 5,9.107 1.108 8,5.108 2,1.109 7,6.108 (Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp) Qua bảng 3.11 cho thấy độ pH môi trường nhân sinh khối có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình sinh trưởng và nhân lên của vi sinh vật, điều đó được thể hiện rõ ở mật độ tế bào hữu hiệu có trong 1 ml dung dịch mà chúng tồn tại.
Trong môi trường có độ pH thấp, mật độ tế bào trong 1 ml dung dịch tương đối thấp, chỉ đạt 106. Các vi sinh vật đều cho mật độ tế bào lớn đạt đến 108, 109 ở điều kiện pH môi trường 5,5-7.Các chủng P16.1; P40 đạt mật độ cao nhất ở pH môi trường là 6. Chủng P08, P43 đạt mật độ tế bào cao nhất ở pH = 5,5. Chủng P37 đạt mật độ cao nhất ở điều kiện pH = 6,5.
3.2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tập hợp chủng.
Kiểm tra tính đối kháng giữa 3 chủng VSV sinh màng nhầy đã tuyển chọn trong 3 chủng VSV sinh màng nhầy (Chủng Bacillus megaterium P16.1;
Bacillus aryabhattai P08 và Klebsiella variicola P40) để xem trong quá trình
sinh trưởng và phát triển chúng có ức chế nhau không là việc làm rất cần thiết.
Bởi vì nếu các chủng VSV không ức chế nhau thì chúng ta mới có thể sản xuất chế phẩm.
Dùng phương pháp cấy vạch,3 chủng VSV Bacillus megaterium P16.1;
Bacillus aryabhattai P08 và Klebsiella variicola P40 được cấy thành các đường thẳng vuông góc, mỗi chủng đều cắt nhau tại nhiều điểm và sau 96 giờ cấy. Nếu tại các điểm cắt nhau, các chủng vẫn phát triển bình thường thì chứng tỏ chủng không đối kháng nhau, còn nếu tại các điểm cắt nhau các chủng không phát triển chứng tỏ các chủng đối kháng nhau.
Kết quả kiểm tra cho thấy 3 chủng VSV đã tuyển chọn trong đó có không đối kháng nhau. Như vậy chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng 5 chủng VSV này để sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy nhanh vật liệu cháy dưới tán rừng.
3.2.3 Kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học
Nghiên cứu thử nghiệm chất mang được thực hiện bởi 6 công thức kết quả dược trình bày ở bảng 3.12:
Bảng 3.12: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của chất mang đến mật độ VSV trong sản xuất chế phẩm
Stt Thời gian bảo quản
Mật độ tế bào của các chủng VSV (cfu/g)
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6
1 1 tháng 6,0.107 6,1.107 7,9.107 5,9.107 5,5.107 5,4.107 2 2 tháng 5,7.107 5,8.107 7,2.107 5,7.107 5,2.107 5,1.107 3 3 tháng 5,3.107 5,2.107 6,8.107 5,0.107 5,1.107 4,8.107 4 4 tháng 5,1.107 5,0.107 6,4.107 4,8.107 4,9.107 4,6.107 5 5 tháng 4,9.107 4,8.107 6,1.107 4,5.107 4,5.107 4,3.107 6 6 tháng 4,5.107 4,4.107 5,9.107 3,9.107 4,3.107 4,0.107
(Nguồn: TS. Vũ Văn Định – Viện Khoa Học Lâm Nghiệp) Từ bảng kết quả 3.12 cho thấy ở các công thức các chủng VSV đều đảm bảo mật độ trong sản xuất chế phẩm 107 cfu/g. Trong đó CT3 (80% Mùn hữu cơ + 10% apatits + 10% dịch VSV sinh màng nhầy) mật độ đạt cao nhất sau 6 tháng bảo quản chế phẩm đạt 5,9.107 cfu/g.
Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu
- Mùn hữu cơ phơi khô loại bỏ tạp chất và tránh nấm mốc sàng và đóng bao sẵn; apatits phơi khô nghiền nhỏ.
Bước 2: Hoạt hóa giống
Để có được các giống khỏe thích nghi tốt với điều kiện nuôi cấy tiến hành hoạt hóa giống. Chuẩn bị các ống thạch nghiêng (có nút bông) có chứa môi trường AT. Khử trùng môi trường thạch trong ống nghiệm ở 1210C, thời gian 30 phút. Khi môi trường còn nóng (60-700C), đặt nghiêng 300 để cho thạch tạo thành mặt phẳng nghiêng. Cấy giống từ ống giống gốc sang ống thạch nghiêng mới chuẩn bị. Nuôi VSV ở tủ định ôn ở thang nhiệt độ 250C trong khoảng 96- 120 giờ, tới khi thấy chủng phát triển tốt thì cấy vào môi trường nhân giống cấp 1, các thao tác cấy truyền được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Môi trường AT lỏng: Môi trường AT lỏng bao gồm: 20g CaCO3; 20g D- Glucose; 0,8g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,2g KH2PO4; 0,1 FeCl3. 6H2O;
0,05g Na2MoO4.2 H2O; Nước cất 1000ml.
Bước 3: Nhân giống cấp 1
Chuẩn bị các bình tam giác 250 ml (có nút bông), sấy tiệt trùng 1 giờ ở 1600C. Cho vào mỗi bình 200 ml môi trường AT lỏng, khử trùng môi trường nhân giống cấp 1 ở 1210C, thời gian 20 phút, để nguội về nhiệt độ phòng mới cấy giống. Cấy truyền 1 vòng que cấy từ ống giống mới vào môi trường nhân giống cấp 1. Các thao tác cấy truyền ống nghiệm vào bình tam giác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi ở trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 250C trong 72 giờ ta thu được giống cấp 1.
Môi trường AT lỏng: Môi trường AT lỏng bao gồm: 20g CaCO3; 20g D- Glucose; 0,8g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,2g K2HPO4; 0,1 FeCl3. 6H2O;
0,05g Na2MoO4.2 H2O; Nước cất 1000ml.