I. Các u biểu mô I Các u không thuộc biểu mô
1.4. Hoá mô miễn d ch và ứng dụn tron un thƣ tuy n tiền liệt
H a mô miễn dịch l kết hợp phản ứng miễn dịch v h a chất để l m hiện rõ các kháng nguy n hiện diện trong mô (m ng, o tương v nh n tế o). V kháng nguy n không thể quan sát h nh thái được, cho n n người ta phải xác định vị trí c a n tr n tế o ằng các phản ứng miễn dịch v h a học.
Nguyên tắc: KT đặc hiệu với KN cần xác định (trên lát cắt mô), nếu có mặt KN sẽ có phản ứng KN - KT, có thể quan sát đƣợc bằng cách “đánh dấu” ph n tử KT đặc hiệu.
+ Đánh dấu bằng chất huỳnh quang, có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
+ Đánh dấu bằng enzym: khi bổ sung cơ chất t o m u tương ứng với enzym, sẽ gi p “nhuộm m u” KN cần xác định, nhờ đ c thể quan sát đƣợc KN dưới kính hiển vi quang học.
Trong k thuật HMMD, KN là những phân tử protein cần xác định trên lát cắt mô (có thể là protein màng tế b o, o tương hoặc nhân tế bào). KT (đặc hiệu với KN cần xác định) đƣợc sử dụng làm thuốc thử. Có thể sử dụng duy nhất một KT đƣợc đánh dấu hoặc sử dụng hai KT, trong đ KT thứ nhất đặc hiệu với KN cần xác định, KT thứ hai đặc hiệu với KT thứ nhất, sử dụng làm KT phát hiện đƣợc “đánh dấu” ằng enzym, chất huỳnh quang. Phần lớn các KT đƣợc d nglà IgG, tiếp đến l IgM. KT tiếp x c trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất. Tuỳ theo cách sản xuất, có hai lo i KT:
+ Kháng thể đa d ng: KT đa d ng đƣợc sản xuất ằng việc g y miễn dịch cho động vật với KN đặc hiệu. Động vật đáp ứng miễn dịch v t o ra kháng huyết thanh, ao gồm nhiều kháng thể đặc hiệu (với các QĐKN khác nhau trên phân tử KN) v không đặc hiệu, sau đ , các KT ngo i muốn ị lo i ỏ. KT đa d ng dễ sản xuất v nh y hơn KT đơn d ng, tuy nhi n cũng c một số ất lợi nhƣ: KT đa d ng c thể chứa các KT phản ứng không đặc hiệu với các KN v kháng thể đa d ng c khuynh hướng nhuộm nền cao.
+ Kháng thể đơn d ng (monoclonal anti ody): đặc hiệu với một QĐKN duy nhất, vì vậy c tính đặc hiệu cao, ít hoặc không có phản ứng chéo.
Phản ứng KN – KT: sự tương tác KN – KT l li n kết không đồng h a trị, phụ thuộc rất nhiều v o cấu tr c không gian a chiều c a vị trí tương tác
tr n cả ph n tử KN v KT. Sự tương tác dựa v o li n kết hydro, li n kết tĩnh điện, lực li n kết Vander Waals v sự kị nước từ các nh m không c ng cực.
Lực li n kết quyết định ái lực c a các KT với KN. Các KT c a một quyết định kháng nguy n giống nhau c thể c cấu tr c khác nhau do vậy c ái lực khác nhau.
Các chất đánh dấu: l chất d ng để phát hiện phức hợp KN - KT ằng mắt thường. Chất đánh dấu c thể được gắn với các chất khác (kháng thể hoặc protein ), hoặc n c thể t o th nh một phức hợp với các KT đƣợc đánh dấu.
Tác động c a một chất đánh dấu đến các đặc tính li n kết c a protein m n sẽ kết nối phải được xem x t trước khi sử dụng.
+ Kháng thể: các KT không gắn kết c thể đƣợc phát hiện.
+ Thuốc nhuộm: chất m u đầu ti n d ng để gắn với kháng thể l thuốc nhuộm, nhƣng phức hợp kháng thể – thuốc nhuộm n y c độ nh y thấp. Nếu c tr n 10 ph n tử thuốc nhuộm gắn với 1 ph n tử kháng thể sẽ l m thay đổi phản ứng miễn dịch.
+ Các hợp chất huỳnh quang: các chất n y khi ị kích thích ởi ánh sáng sẽ phát ra ánh sáng ở các ƣớc s ng đặc trƣng cho các hợp chất huỳnh quang đƣợc sử dụng.
+ Các enzym: peroxidase l một protein c trọng lƣợng 40 kD, đ y l một enzym được sử dụng l chất đánh dấu rộng rãi nhất. Trước khi phát hiện ra phương pháp C ( vidin- iotin Complex), các kháng thể gắn peroxidase đƣợc t o ra ởi li n kết h a trị c a peroxidase với KT ở nh m aldehyde c a vỏ car ohydrate c a enzym. Peroxidase đƣợc phát hiện ởi n c khả năng khử H2O2 th nh nước khi c sự hiện diện c a các điện tử được cung cấp. Một số hợp chất đƣợc sử dụng để hiện m u với peroxidase l diaminobenzidine, 3-amino-9-ethylcarbazole.
Hệ thống ABC (Avidin-Biotin Complex)
+ KT phát hiện: gắn biotin
+ Phân tử đánh dấu không gắn trực tiếp lên KT phát hiện, thay v o đ , phân tử đánh dấu (thường l enzym) được gắn sẵn với avidin (streptavidin).
Sau khi mẫu mô với KT phát hiện và rửa tiêu bản, enzym gắn avidin sẽ đƣợc ph lên lát cắt mô. Do ái lực cao giữa biotin và avidin, phân tử enzym sẽ được cố định lên KT phát hiện. Bằng cách này, có thể l m tăng cường độ tín hiệu từ mẫu lát cắt mô, do một phân tử avidin có thể kết hợp với tối đa l 4 phân tử biotin.
Hệ thống ph ng đ i dấu hiệu nhận biết gồm một enzym, cơ chất v chất m u. Enzym phải đƣợc gắn với KT thứ hai ằng một phản ứng KN - KT hay ằng cầu nối h a học (avidin v iotin). Cần th m một cơ chất thích hợp với enzym v cuối c ng l chất m u đƣợc gắn l n để c thể thấy được sản ph m, cho ph p xác định sự hiện diện c a KN trong mô dưới kính hiển vi quang học.
C c thuật iễn ch nzy :
+ Miễn dịch enzym trực tiếp: KN (mô) kết hợp với KT c gắn enzym.
Phương pháp n y đơn giản, nhanh, c tính đặc hiệu, nhưng ít nh y do thiếu hệ thống ph ng đ i dấu hiệu nhận iết.
+ Miễn dịch enzym gián tiếp: KN (mô) + KT thứ nhất + KT thứ hai c gắn enzym đồng thời kháng Ig lo i c a KT thứ nhất.
+ K thuật enzym – kháng enzym: KN (mô) + KT thứ nhất + KT thứ hai + KT thứ a kháng enzym + enzym. Phương pháp n y c tính đặc hiệu v nh y hơn hai phương pháp ở tr n.
+ Cầu nối iotin – streptavidin: KN (mô) + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn iotin + streptavidin + peroxidase. Phương pháp n y được sử dụng nhiều v c tính nh y v đặc hiệu cao. vidin c ái lực m nh với iotin v peroxidase l m cầu nối cho peroxidase gắn v o iotin (tr n KT thứ hai). Một ph n tử avidin c 4 vị trí gắn iotin n n hệ thống nhận iết đƣợc ph ng đ i l n 4 lần [40], [41].
1.4.2. g d g hu h iễn dịch trong ch đ bệ h học HMMD có thể xác định những đặc tính sau c a mô:
+ Xác định nguồn gốc c a những u không iệt h a (nhiều lo i u c nguồn gốc khác nhau nhƣng c iểu hiện h nh thái giống nhau).
+ Xác định ung thƣ iểu mô vi x m nhập (trong ung thƣ iểu mô vi x m nhập m ng đáy ị phá h y).
+ Xác định ung thƣ di căn thầm lặng (những ổ di căn ung thƣ nhỏ, kh phát hiện tr n x t nghiệm mô học thường quy).
+ Xác định các kháng nguy n u, ao gồm:
- Kháng nguy n đặc hiệu c a u (gồm các gen sinh u ị đột iến v các sản ph m gen ức chế khối u).
- Thay đổi vị trí ph n ố KN tr n tế o (vị trí ph n ố KN tr n tế o nh thường khác với tế o ác tính, đ l do gia tăng tích tụ KN v m ng tế o ị v i v o o tương).
- Thay đổi mức độ tăng hoặc giảm iểu hiện kháng nguy n tr n tế o (một số kháng nguy n gia tăng iểu hiện ở các tế o ác tính, một số khác l i giảm iểu hiện, các kháng nguy n n y kết hợp với chức năng iệt h a c a tế o. Mặc d nhiều khối u vẫn tiếp tục sản xuất ra các sản ph m như tế o nh thường v mất dần khi tế o iệt h a kém).
- Những iến đổi sinh h a c a KN.
+ Xác định yếu tố ti n lƣợng trong ung thƣ (các KN li n quan đến sự tăng sinh tế o, đặc iệt l chỉ số ph n o v độ mô học c a u).
+ Ch n đoán u l nh với u ác tính.
+ Dự đoán đáp ứng c a u với điều trị [42], [43], [44].
ng dụng k thuật HMMD trong ch n đoán UT M TTL:
Hầu hết UT M TTL c thể đƣợc ch n đoán ằng sử dụng các ti u chu n mô ệnh học, ảo đảm ph n lo i phần lớn cho các típ v iến thể c a
UTBM TTL. Tuy nhiên, những kh khăn gặp phải trong quá trình ch n đoán mô bệnh học ao gồm:
+ Một số tổn thương l nh tính c a TTL dễ nhầm với ác tính v ngược l i, một số tổn thương ác tính c a TTL dễ nhầm là lành tính.
+ Những tổn thương nghi ngờ do di căn hoặc xâm lấn c a ung thư từ nơi khác đến TTL.
+ Xác định típ v iến thể c a UTBM TTL.
+ Những mẫu mô sinh thiết nhỏ, kh kết luận.
Trong những trường hợp tr n, cần c các k thuật như HMMD để hỗ trợ ch n đoán. Tr n thế giới, nhiều nghi n cứu đã đƣợc thực hiện nhằm x y dựng một ảng các KT thích hợp trong x t nghiệm HMMD đánh giá ệnh TTL [45], [46], [47]. Ở trong nước, phần lớn các nghi n cứu về UT M TTL đề cập đến những đặc điểm l m s ng, x t nghiệm PS huyết thanh v điều trị UT M TTL. Việc nghi n cứu đánh giá sự ộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong UT M TTL chƣa nhiều, chƣa đầy đ v hệ thống [48]. Chính v vậy, ch ng tôi lựa chọn một số dấu ấn miễn dịch nhƣ: kháng nguy n đặc hiệu tuyến tiền liệt, cytokeratin trọng lƣợng phân tử cao d ng 34 etaE12, p63, cytokeratin 7, cytokeratin 5 6, actin v tiến h nh nhuộm HMMD để đánh giá sự ộc lộ các dấu ấn n y trong UT M TTL [11], [49], [50].
* Kháng nguy n đặc hiệu tuyến tiền liệt
Năm 1979, sau khi phát hiện ra kháng nguy n đặc hiệu tuyến tiền liệt (prostate specific antigen: PS ), PS đã trở thành một dấu ấn miễn dịch rất hữu ích đối với các tổ chức TTL. PS không c trong mô TTL trước tuổi dậy th , đã nhiều công trình nghiên cứu sự phân bố PS trong mô cũng nhƣ nồng độ c a PSA trong huyết thanh v coi n nhƣ l yếu tố dự báo UTBM TTL [51]. Các KT đơn d ng v đa d ng trực tiếp kháng l i kháng nguy n n y, thường phản ứng rất m nh và lan tỏa trong o tương c a các tế o nang tuyến và ống tuyến ở tất cả các v ng c a tổ chức TTL nh
thường v TTL tăng sản. Các tế o đáy, iểu mô c a ống phóng tinh, túi tinh cũng như iểu mô đường niệu v iểu mô các ống quanh niệu đ o không ộc lộ PSA khi nhuộm HMMD với kháng thể kháng PS . Do có tính đặc hiệu cao với TB biểu mô tuyến c a TTL, PS đã thể hiện là một dấu ấn rất hữu ích cho hầu hết các UTBM TTL [52].
Các nghiên cứu chỉ ra trong UTBM TTL, khi nhuộm HMMD với kháng thể kháng PS cho thấy:
- Các tế bào biểu mô chế tiết thuộc tất cả các vùng c a TTL (+) PSA.
- Các tế bào đáy m tính (-) PSA.
- UT M TTL nguy n phát v UT M TTL di căn (+) PS .
- Các tế bào biểu mô túi tinh, ống phóng tinh, biểu mô chuyển tiếp ở niệu đ o, các ống dẫn lớn quanh niệu đ o v UT M đ i tràng (-) PSA [11].
* Cytokeratin 5/6
Cytokeratin 5/6 (CK5/6) có trọng lƣợng phân tử cao (56 kD và 58 kD).
Hầu hết UTBM tế bào vảy bộc lộ ƣu thế cytokeratin trọng lƣợng phân tử cao dòng 34βE12 v CK5 6. Do đ , sử dụng kháng thể kháng CK5 6 sẽ giúp ích cho việc xác định các ổ dị sản tế o vảy trong tăng sản TTL, các ổ biệt h a tế o vảy trong UT M đường niệu biệt hóa kém, UTBM TTL lo i tế o vảy v di căn hoặc xâm lấn c a UTBM tế o vảy từ nơi khác v o TTL [49], [53].
Khi nhuộm HMMD với kháng thể kháng CK5 6 cho thấy:
- UTBM tế bào vảy (+) CK5/6.
- Tế bào chế tiết TTL ác tính(+) CK5 6 (dưới 10 các trường hợp).
- U trung mô ác tính (+) CK5/6.
- UT M đ i - trực tr ng (+) CK5 6 (dưới 10 các trường hợp)
* Cytokeratin trọng lƣợng phân tử cao dòng 34betaE12
Cytokeratin dòng 34betaE12 (CK34βE12), đ y l những cytokeratin có trọng lƣợng phân tử cao (từ 57 kD đến 66 kD) đã đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một dấu ấn miễn dịch đặc hiệu tế o đáy. Các tế o đáy v tế o nang
tuyến TTL có phản ứng miễn dịch với các CK trọng lƣợng phân tử thấp. Tuy nhiên, chỉ có các tế bào đáy l c phản ứng miễn dịch với các CK trọng lƣợng phân tử cao, do đ m CK34βE12 đƣợc coi l dấu ấn đặc hiệu T đáy. iểu mô vảy v iểu mô đường niệu cũng c phản ứng miễn dịch với CK34βE12.
Trong UTBM TTL, sự không phân bố lớp tế bào đáy trong các tuyến nang là một hình ảnh rất quan trọng để ch n đoán ung thƣ x m nhập, khi các tế bào đáy c thể không rõ ràng khi nhuộm H.E. Nhuộm HMMD có thể trợ giúp phân biệt UTBM TTL xâm nhập với tăng sản nang tuyến nhỏ có cấu trúc giống nhƣ ung thƣ nhƣng l i có sự phân bố lớp tế bào đáy. Tuy nhi n, trong teo đ t tuyến, tăng sản sau teo đ t, tăng sản tuyến mất điển h nh, tăng sản tuyến xơ h a v tế bào mất điển hình sau chiếu tia… các tế bào đáy c thể bị gián đo n hoặc không thể chứng minh đƣợc ở một số các tuyến lành tính thì sự không ph n ố lớp tế bào đáy trong các ổ nhỏ các nang tuyến không thể sử dụng đơn độc nhƣ l một tiêu chu n xác định cho sự ác tính. Hơn nữa, sự vắng mặt c a lớp tế bào đáy chỉ hỗ trợ ch n đoán ung thƣ x m nhập trong các trường hợp tăng sản mà có biểu hiện nghi ngờ về tế bào hoặc có biểu hiện nghi ngờ về hình ảnh cấu trúc trên các tiêu bản nhuộm H.E. Trái l i, một số trường hợp UTBM TTL ở giai đo n sớm, ung thư vi x m nhập phát sinh trong sự phối hợp với PIN độ cao hay độc lập với PIN độ cao, có thể c n s t l i các tế bào đáy. Sự lan tràn trong lòng ống tuyến c a ung thƣ x m nhập và các ống tuyến lành tính bị tắc nghẽn bởi sự lan tràn c a các tế bào u là cách giải thích khác cho các tế bào đáy c n s t l i. Trong UTBM TTL hiếm khi thấy các đám tế o ung thƣ nằm rải rác mà những đám tế bào này có phản ứng miễn dịch với kháng thể kháng CK34βE12. Ngoài ra, sử dụng kháng thể kháng CK34βE12 c n đặc biệt giúp ích cho ch n đoán các iến thể c a UTBM TTL mà chúng có biểu hiện giống nhƣ lành tính [11], [53].
Khi nhuộm HMMD với KT kháng cytokeratin d ng 34βE12 cho thấy:
- Các TB chế tiết TTL lành tính và ác tính (-) CK34βE12.
- Các tế bào đáy TTL (+) CK34βE12.
- Biểu mô đường niệu (-) CK34βE12.
- Biểu mô vảy (+) CK34βE12.
Nhƣ vậy, sử dụng kháng thể kháng CK34βE12 đã gi p ích cho việc phân biệt giữa UTBM TTL với các tổn thương l nh tính c a TTL (một số tổn thương c a TTL như: teo tuyến, tăng sản sau teo đ t, u tuyến tế bào đáy v PIN…khi lớp tế bào đáy không thấy rõ trên kính hiển vi quang học). Để phân biệt các tổn thương l nh tính nhưngc đặc điểm mô học dễ nhầm với UTBM TTL, người ta đã sử dụng kháng thể kháng CK34βE12, nếu thấy lớp tế bào đáy v dấu ấn miễn dịch c a chúng, dù liên tục hoặc là không liên tục th đ là bằng chứng để khẳng định tính chất lành tính c a tổn thương. Đối với các tổn thương như UT M tuyến nang biến thể teo đ t th thực sự không còn tế bào đáy v dấu ấn CK34βE12 [11], [49], [54].
* p63
p63 là một protein c a nh n tế o, đƣợc mã hóa bởi 1 gen nằm ở nhiễm sắc thể số 3q27-29, p63 l một th nh vi n c a họ protein p53 (gen ức chế khối u) tham gia v o điều chỉnh tăng sinh v phát triển c a các lo i tế o biểu mô nhƣ: iểu mô da, iểu mô cổ tử cung, iểu mô tuyến v v iểu mô đường niệu dục. Kháng thể kháng p63 đặc hiệu với nhân c a các tế bào đáy c a tuyến tiền liệt. V vậy, kháng thể kháng p63 đƣợc d ng để ch n đoán UT M TTL cũng như d ng để phân biệt các tổn thương l nh tính với tổn thương ác tính c a TTL.
+ Nhuộm HMMD với kháng thể kháng p63 c những lợi thế nhƣ sau:
- t ị ảnh hưởng bởi các biến đổi c a mẫu mô.
- Khi nghi ngờ tế bào đáy (-) CK34βE12.
- Dễ đọc kết quả, do cường độ bắt màu c a nhân rất m nh và ít khi bị nhuộm nền [55], [56].
+ Khi nhuộm HMMD với kháng thể kháng p63 cho thấy:
- UTBM TTL (-) p63.
- TTL l nh tính, ung thư đường niệu (+) p63.
- U tuyến t o thận (-) p63.
- UTBM tế bào vảy (+) p63.
* Cytokeratin 7
Cytokeratin7 (CK7) có trọng lƣợng phân tử 54 kD đƣợc mã h a ởi gen KRT7. Cytokeratin7 phân bố rộng rãi trong các lo i tế bào biểu mô đơn. Các nghiên cứu đã chứng minh mối liên quan giữa sự bộc lộ CK7 trong tế bào biểu mô nh thường và tế bào ung thư trong c ng một mô.
Khi nhuộm HMMD với kháng thể kháng CK7 cho thấy:
- Tế bào chế tiết TTL lành tính và ác tính (-) CK7 - UT M đường niệu và u tuyến t o thận (+) CK7 - Biểu mô đường niệu (+) CK7.
- BM tế bào vảy v UT M tế o vảy (-) CK7.
- Ung thƣ nh y (-) hoặc (+) CK7.
- UT M đ i- trực tr ng, d d y, ruột (-) CK7 [43], [44], [49].
* ctin đặc trƣng cơ
Actin là thành phần chính c a khung tế o. Sợi actin, mặc d về si u cấu tr c l thuần nhất, nhƣng c tới 6 đồng ph n. Các đồng ph n c a actin ph n ố đặc trƣng cho các mô khác nhau. Sử dụng kháng thể kháng actin đặc trƣng cơ để nhận ra sợi actin c a tế o cơ trơn, cơ v n, nguy n o xơ - cơ, tế o cơ iểu mô. Nhƣ vậy, sử dụng KT kháng actin đặc trƣng cơ để xác định các tế o không phải l tế o cơ nhƣ: tế o nội mô m ch máu v tế o c a các tổ chức liên kết khác. Sử dụng kháng thể kháng actin đặc trƣng cơ cũng gi p ích cho việc nhận ra các thành phần tế o d ng cơ v n v các tế o c a các khối u phát sinh từ tổ chức không phải l cơ nhƣ: ung thƣ iểu mô, u sắc tố, u limphô…[11], [47], [49]. Nhuộm HMMD với kháng thể kháng actin đặc trƣng cơ:
- Tế bào cơ trơn (+) actin.
- Tế o đáy, tế o xơ, tế bào trung mô (-) actin.