Ảnh 3.25. T bào u xâm nhập dây
3.4. K t quả nghiên cứu tình tr ng methyl hóa gen RASSF1A
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra chất ƣợ g ADN đƣợc tách chiết từ mẫu mô ung t ƣ ểu mô tuyến v tă g sản tuyến tiền li t với cặp m i GL-F/GL-R của
gen β - globulin.
L: thang chuẩn 100bp, -- : ối chứng (n ớc thay cho ADN khuôn), P1-P20: các mẫu ng h ừ 1-20, B1-B10: các mẫ ăng ản từ 1-10.
Sản ph m PCR đƣợc điện di tr n gel agarose 1.5 . Đối chứng âm (nước thay cho DN khuôn) không l n ăng chứng tỏ các thao tác k thuật đảm bảo tính chính xác c a kết quả. Tất cả các mẫu đều l n ăng đặc hiệu với kích thước là 250bp, chứng tỏ ADN tổng số được tách chiết tốt, đảm bảo chất lƣợng cho các thí nghiệm sau.
3.4.2. Kết quả đ h gi hiệu uả c u h x l bi ulfi e
PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhằm khuếch đ i gen β-globin từ ADN tổng số trước và sau xử lý với isulfite được trình bày trên hình 3.2.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR nhân bản gen β-globin từ hu n trƣ c ăn ỏ) và sau xử l ăn v n v i bisulfite của mẫu un thƣ v
mẫu tăn sản tuy n tiền liệt.
Ghi chú: P1-P20 ký hiệu các mẫ ng h ừ n 20, B1-B10: ký hiệu mẫu mô ng h ẫ ăng ản, L: thang chuẩn ADN 100bp, (-): ối chứng âm.
(-) (-)
Kết quả cho thấy các khuôn ADN tách chiết từ các mẫu ung thƣ và tăng sản TTL đều cho phép khuếch đ i gen β-globin với kích thước khoảng 250 bp. Điều này chứng tỏ ADN tổng số đƣợc tách chiết có chất lƣợng đảm bảo cho xử lý với bisulfite. Sử dụng ADN sau khi xử lý với isulfite để làm khuôn cho phản ứng nhân bản gen β-globin, ch ng tôi không thu đƣợc sản ph m c kích thước 250 bp. Điều này chứng tỏ các mẫu ADN tổng số đã đƣợc xử lý hoàn toàn với bisulfite.
3.4.3. Kết quả x c định sự methyl hóa gen RASSF1A ở các mẫu u g hư Kết quả MSP với các mẫu ung thƣ đƣợc trình bày trên hình 3.3. Phản ứng MSP nhằm phát hiện sự methyl hóa gen RASSF1A đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu bằng k thuật PCR. Sản ph m PCR phát hiện methyl hóa bằng cặp mồi đặc hiệu RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R có kích thước l 170 p. Tương tự, để phát hiện gen RASSF1A có cytosine không bị methyl hóa (cytosine này sẽ bị thay thế thành thymine sau khi bị xử lý với bisulfite), phản ứng MSP cũng đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu bằng phương pháp nested PCR (PCR lồng). Sản ph m PCR lần thứ nhất với cặp mồi đặc hiệu RASSF1A-Un-F1/RASF1A-Un-R1 đƣợc pha loãng 100 lần và đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng lần thứ hai với cặp mồi RASSF1A- Un-F2/RASSF1A-Un-R2.
Hình 3.3. Sản phẩm MSP nhân bản gen RASSF1A từ khuôn ADN b xử lý bằng bisulfite của 20 mẫu un thƣ từ P1 n P20) v i cặp mồi methyl
RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R và cặp mồi không methyl RASSF1A-Un-F2/ RASSF1A-Un-R2.
Ghi chú: Sản phẩ P R c iện di trên gel acrylamide 10%. L: thang chuẩn ADN 100 (*): ăng N c ch h ớc 170 bp. (-): ối chứng (n ớc thay cho ADN khuôn).
ăng DN đặc hiệu c a gen RASSF1A bị methyl h a c kích thước 170 bp (ký hiệu m) đƣợc phát hiện trong 11/20 mẫu ung thƣ TTL. ăng DN đặc hiệu cho RASSF1A không bị methyl h a c kích thước 137 bp (ký hiệu u) cũng đƣợc phát hiện trong 20 mẫu ung thƣ. Đ y l sản ph m đặc trƣng cho các tế bào lành lẫn trong mẫu ung thƣ. Điều này chứng tỏ DN đã đƣợc xử lý bisulfite tốt và các cặp mồi đã đƣợc thiết kế đặc hiệu chính xác đối với gen RASSF1A.
3.4.4. Kết quả xác định sự methyl hóa gen RASSF1A ở các mẫu tăng sản tuyến tiền liệt
Kết quả MSP với các mẫu tăng sản TTL đƣợc trình bày trên hình 3.4.
Tương tự với các mẫu ung thư TTL, phản ứng MSP nhằm phát hiện sự methyl
hóa gen RASSF1A đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu RASSF1A-M210- F/RASSF1A-M211-R, sự không methyl hóa DN đƣợc phát hiện bằng cặp mồi RASSF1A-Un-F2/RASSF1A-Un-R2.
Hình 3.4. Sản phẩm MSP nhân bản gen RASSF1A từ khuôn ADN b xử lý v i bisulfite của 10 mẫu tăn sản tuy n tiền liệt (từ 1 n B10).
Ghi chú: (m): ký hiệ ăng N methyl hóa, (u): ký hiệ ăng N h ng methyl hóa. Sản phẩ P R c iện di trên gel acrylamide 10%. L-Thang chuẩn ADN 100 bp.
(-): ối chứng (n ớc thay cho ADN khuôn).
Tất cả các mẫu mô tăng sản TTL c ăng DN đặc hiệu cho RASSF1A không bị methyl hóa (ký hiệu u) cho sản ph m c kích thước l 137 p. ăng DN đặc hiệu cho RASSF1A bị methyl h a c kích thước 170 bp (ký hiệu m) đƣợc phát hiện trong 2/10 mẫu tăng sản TTL.
3.4.5. Đối chiếu tình trạng e hyl h ge SS 1 ới ộ ố đặc điể bệ h học g u g hư biểu mô tuyến
3.4.5.1. Tỷ lệ m h h g n R SS ng ng h bi u mô tuy n ăng ản nh nh n tiền liệt
Bảng 3.23. Tỷ lệ thyl hóa tron un thƣ biểu mô tuy n v tăn sản tuy n tiền liệt
Mô bệnh học Số lƣợng (n=30)
Tỷ lệ methyl hóa (%)
Ung thƣ biểu mô tuyến 20 11/20 (55%)
Tăng sản TTL 10 2/10 (20%)
Tổng số 30
Tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A trong UTBM tuyến c a TTL l 55%, trong tăng sản lành tính TTL là 20%.
3.4.5.2. Methyl hóa gen RASSF1A với Gleason của u
Bảng 3.24. Tỷ lệ methyl hóa theo ộ Gleason
Độ Gleason Số lƣợng mẫu (n=20) Tỷ lệ methyl hóa (n%)
2 8 2 (25%)
3 6 3 (50%)
4 3 3 (100%)
5 3 3 (100%)
Tổng số 20 rho= 0,605; p = 0,005
Tỷ lệ methyl h a tăng theo độ Gleason c a khối u: với hệ số tương quan rho = 0,605; p < 0,01.
3.4.5.3. Methyl hóa gen RASSF1A với i n biệt hóa của u Bảng 3.25. Tỷ lệ thyl hóa th o iể l ason ộ biệt hóa Điểm Gleason Độ biệt hóa Số lƣợng mẫu
(n=20)
Tỷ lệ methyl hóa (n %)
2-4 Cao 7 2 (28,6%)
5-7 Vừa 8 4 (50%)
8-10 Biệt hóa kém 5 5 (100%)
Tổng số 20
Hệ số Spearman rho = 0,530; p = 0,016
Tỷ lệ methyl h a tăng cao theo điểm Gleason độ biệt hóa c a khối u:
28,6% ở nhóm khối u điểm Gleason 2-4/biệt hóa cao, 50% ở nhóm khối u điểm Gleason 5-7/biệt hóa vừa, 100% ở nhóm khối u điểm Gleason 8-10/biệt hóa kém.
3.4.5.4. Methyl hóa gen RASSF1A với tình tr ng u xâm l n dây thần kinh Bảng 3.26. Tỷ lệ methyl hóa theo tình tr ng u xâm lấn dây th n kinh
Xâm lấn y th n inh
Số lƣợng mẫu (n=20)
Tỷ lệ methyl hóa (n %)
Có 7 6/7 (85,7%)
Không 13 5/13 (38,5%)
Tổng số 20
Hệ số Spearman rho = 0,453; p = 0,045
Tỷ lệ methyl hóa ở nhóm khối u xâm lấn dây thần kinh là 85,7%, nhóm khối u không xâm lấn dây thần kinh là 38,5%. Có sự tương quan với p < 0,05.
3.4.5.5. Methyl hóa gen RASSF1A ng ăng ản lành tính tuy n tiền liệt với nh ng PIN
Bảng 3.27. Tỷ lệ methyl hóa trong tăn sản tuy n tiền liệt theo tình tr n PIN
Mô bệnh học Số lƣợng mẫu (n=10)
Tỷ lệ methyl hóa (n %) Tăng sản TTL phối hợp PIN độ thấp 5 2/5 (40%) Tăng sản TTL không phối hợp PIN 5 0/5 (0%) Tổng số 10
Tỷ lệ methyl hóa trong tăng sản TTL phối hợp với PIN độ thấp là 40%. Không phát hiện methyl hóa trong tăng sản TTL không phối hợp với PIN độ thấp.
C ƢƠ BÀN LUẬN
4.1. Phân bố tỷ l b â u g t ƣ ểu mô tuyến tiền li t theo nhóm tuổi Kết quả nghiên cứu về tuổi bệnh nhân mắc UTBM TTL c a chúng tôi ở bảng 3.1 cho thấy: tỷ lệ bệnh nhân mắc UT M TTL tăng l n theo từng nhóm tuổi, cao nhất ở nhóm tuổi 70-79 (42,86%), thấp nhất ở nhóm tuổi 40-49 (1,19%), nhóm tuổi 50-59 chiếm tỷ lệ 4,76%, nhóm tuổi 60-69 chiếm tỷ lệ 23,81%, nhóm tuổi ≥ 80 chiếm tỷ lệ 27,38 , tuổi trung nh l 74,34 9,27.
Tuổi thấp nhất 49 tuổi, tuổi cao nhất 90 tuổi, không gặp trường hợp nào tuổi dưới 40. So sánh kết quả này c a chúng tôi với kết quả đã công ố c a một số tác giả trong nước v nước ngoài, chúng tôi thấy không có sự khác biệt nhiều.
Theo Nguyễn Việt Hải (2013) [20], tỷ lệ mắc UTTTL tăng dần theo tuổi:
nhóm tuổi 50-60 (10,14%), 61-70 (18,84%), 71-80 (44,93%), 81-90 (24,63%), nhóm tuổi trên 90 tuổi (0,72%), tuổi cao nhất là 92 tuổi, tuổi trẻ nhất là 34 tuổi, tuổi trung nh c a ệnh nh n l 73,80 9,70. Kết quả c a Ngô Văn Trung (2004) [120], cho thấy tỷ lệ mắc UT M TTL cũng tăng l n theo nhóm tuổi, cao nhất ở nhóm tuổi 71-80 (51,7%), thấp nhất ở nhóm tuổi trên 80 tuổi (12,1 ), tuổi tr n 61 (47 58; 81 ). Qua nghi n cứu về tuổi mắc UT M TTL, ch ng tôi thấy hầu hết các ệnh nh n trong nghi n cứu c a ch ng tôi ở tuổi tr n 60 (79 84; 94 ), c n l i l dưới 60 tuổi (5/84; 6%).
Nhiều nghiên cứu khác ở trong nước v nước ngo i đều cho thấy tỷ lệ mắc UTTTL tăng theo tuổi, đặc biệt là tuổi tr n 60, t i Hoa Kỳ thường gặp nhất ở tuổi tr n 50 [121]. Theo Gronberg H. (2003) [122], UTTTL rất hiếm gặp ở tuổi dưới 50 tuổi và chỉ chiếm tỷ lệ dưới 0,1% trong tổng số các bệnh nhân UTTTL, tuổi trung bình là 72-74 tuổi và khoảng 85% bệnh nh n đƣợc ch n đoán UTTTL ở tuổi trên 65 tuổi.