CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.2.4. Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau
Enzyme rất dễ bị giảm hoạt độ dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài, do đó khi tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt độ của enzyme cần tiến hành nhanh quá trình tinh chế trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và môi trường có pH thích hợp [10], [15], [17].
Không có quy trình cụ thể nào để chiết xuất và tinh chế enzyme khác nhau.
Do enzyme có mặt trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật nên quá trình tách và tinh chế enzyme sẽ được thực hiện theo các bước tổng quan sau [6]:
- Thứ nhất phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau như:
+ Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa....
+ Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm.
+ Phương pháp hóa học: sử dụng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate.
- Thứ hai sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo phương pháp trên.
- Thứ ba dung dịch enzyme thô thu được chứa nước, protein không phải enzyme và các tạp chất cần loại bỏ. Vì vậy, để thu được một enzyme nào đó ở dạng tinh khiết có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và nhiều giai đoạn tinh sạch khác nhau.
* Tách enzyme nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ [17]
Khi thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme, lực hút giữa các phân tử protein và các phân tử nước bao quanh chúng bị giảm. Nếu tiếp tục bổ sung dung môi hữu cơ nồng độ dung dịch đạt đến một mức độ nào đó thì các phân tử protein liên hợp với nhau tạo thành kết tủa. Tùy theo tính chất của từng loại protein, dung môi và điều kiện kết tủa mà mỗi enzyme sẽ được kết tủa ở nồng độ enzyme thích hợp nào đó. Các dung môi thường được sử dụng phổ biến để kết tủa enzyme là rượu etylic, isopropylic, ethanol hoặc aceton. Tuy nhiên các dung môi có thể gây nên sự vô hoạt enzyme vì vậy, cần phải tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp.
* Tách enzyme nhờ kết tủa bằng muối trung tính [17]
Khi bổ sung muối đến nồng độ quá bão hòa, các ion muối có tác dụng phá vỡ lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein do sự hút các cực trái dấu của phân tử nước, kết quả là các phân tử protein bị mất lớp vỏ nước và có thể liên hợp lại với nhau để tạo thành phân tử lớn hơn. Tác dụng kết tủa của các ion muối tỷ lệ thuận với lực ion của chúng và như vậy mỗi loại protein trong hỗn hợp sẽ được kết tủa tối đa ở một nồng độ muối xác định nào đó. Muối được dùng phổ biến ở đây là (NH4)2SO4. Ngoài ra, NaCl cũng hay được dùng để kết tủa enzyme động vật.
* Tách enzyme bằng phương pháp hấp phụ không đặc hiệu [17]
Dựa vào tính tương tác của enzyme với chất hấp phụ không cực nhờ tương tác kỵ nước và tương tác Vanderwaals hoặc tương tác protein với các chất hấp phụ có cực nhờ liên kết ion và liên kết hydro. Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ (thường là hydrat oxit nhôm, silica gel hydrat apatit...) khi đó tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại protein, các protein khác nhau sẽ được hấp phụ khác nhau. Sau đó, dùng các dung dịch đệm thích hợp để rút enzyme cần tách ra khỏi cột.
* Tách enzyme bằng phương pháp trao đổi ion [17]
Dựa vào sự trao đổi ion giữa protein (enzyme) tích điện và các chất nhựa trao đổi. Khi cho dịch enzyme chảy từ từ vào cột của chất nhựa trao đổi, protein (enzyme) nào có khả năng đẩy các ion linh động của chất nhựa trao đổi lớn hơn sẽ được giữ lại trên cột trước tiên, còn các protein (enzyme) nào có khả năng đẩy các ion linh động này yếu hơn sẽ được giữ lại chậm hơn trên cột. Sau đó, cho dung dịch chất điện rửa (dung dịch chất điện giải có nồng độ tăng dần) dẫn qua cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các protein vừa liên kết với nhựa. Khi đó, protein (enzyme) nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ bị đẩy ra khỏi nhựa sớm nhất. Kết quả các protein (enzyme) khác nhau sẽ được tách ra ở các thời điểm khác nhau.
1.2.4.2. Tách và tinh chế protease từ thực vật
Quá trình tách chiết và tinh sạch protein từ các nguồn vi sinh vật, động vật và thực vật rất đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu và theo nhiều công trình đã công bố [15], chúng tôi giới thiệu quy trình tổng quát thu nhận enzyme từ thực vật như hình 1.1. Tùy theo loại enzyme có trong thực vật, vị trí các mô và tùy theo mục đích sử dụng mà có thể có các quy trình tách và tinh sạch khác nhau.
Hình 1.1. Quá trình tổng quan thu nhận Enzyme từ thực vật [3], [7], [28], [29]
Các loại củ, quả
Xay nhuyễn, lọc
Dịch lọc
Dung môi hữu cơ
Các loại hạt, khô
Nghiền thành bột
Tách dầu
Trích ly bằng cách ngâm trong đêm ở pH = 4-7
Ly tâm (1400 vòng/ phút, 4oC, 5 phút)
Thu dịch nổi
Kết tủa Enzyme Muối
(NH4)SO4
Ly tâm để thu tủa (1400 vòng/ phút, 4oC, 5 phút)
Thẩm tích để tách muối nếu kết tủa bằng (NH4)SO4
Chế phẩm Enzyme thô
Tinh chế (sắc kí lọc gel hoặc sắc kí trao đổi ion hoặc sắc kí ái lực
Đông khô thu Enzyme tinh khiết