CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford sẽ được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.1.
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mạnh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại ở 595nm. Nhờ đó mà xác định được nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần một giờ [4], [5]. Xây dựng đường chuẩn Albumin, từ đó xác định hàm lượng protein trong V(ml) để chế phẩm thô được tính theo công thức:
mgprotein = b*10-3*m*V (CT1) Trong đó
b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (mg/ml).
m: hệ số pha loãng.
V: thể tích dung dịch chế phẩm enzyme thô (ml).
àgtyrozin ì 0,8 t
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano được trình bày ở phụ lục 1.2 [2], [11].
Nguyên tắc: protein (casein) làm cơ chất. Xác định độ hoạt động phân giải protein của enzyme trên cơ sở xác định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng, bằng phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Đơn vị hoạt động của proteolitic (casein) là lượng enzyme mà trong 60 phút ở 30ºC có khả năng phân giải protein tạo các sản phẩm hòa tan trong trichloroacetic, cho phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với 1àg tyrosin. Hoạt độ riờng của cỏc chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt động proteolitic trên 1ml protein chế phẩm [22]. Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosin và dựa vào đồ thị đường chuẩn tớnh lượng àg tyrozin tương ứng.
Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 0,2ml dung dịch enzyme đã lấy xác định hoạt độ theo công thức:
Hp/ml = (đơn vị) (CT2) Trong đó:
0,8: thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng (0,2ml cơ chất, 0,2ml dung dịch enzyme, 0,4ml dung dịch TCA (acid trichloroacetic)).
t: thời gian để enzyme tác dụng với cơ chất (30 phút).
2.3.4. Phương pháp vật lý
+ Xác định pH bằng máy đo pH điện tử hiệu Hansan – Ý.
+ Đo mật độ quang trên máy đo quang phổ: UV- Nhật Bản.
2.3.5. Phương pháp cơ học
Sử dụng các biện pháp xử lý cắt cuốn để thu dịch nhựa từ quả.
Phương pháp lọc, ly tâm để tách dịch nhựa.
2.3.6. Phương pháp xác định độ mềm thịt bò 2.3.6.1. Cách lấy mẫu
Mẫu thịt bò (longissimus dorsi) được lấy tại hai cơ sở giết mổ gia súc: tại Hương An, thị xã Hương Trà và tại Thủy Xuân, thành phố Huế. Sau 2 giờ giết thịt, mẫu được xử lý và phân tích độ dai và các chỉ tiêu liên quan như tỷ lệ mất nước và màu sắc của thịt bò. Các chỉ tiêu được theo dõi sau 0, 5, 10, 15 và 20 phút sau khi bổ sung chế
phẩm ficin và bên cạnh đó, mẫu đối chứng được tiến hành song song. Các chỉ tiêu phân tích được tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.
2.2.6.2. Xác định độ dai
Độ dai của thịt bò được xác định theo phương pháp của Honikel và cộng sự (1998). Đo độ dai tại 5 vị trí khác nhau trên mẫu (mẫu trước và sau luộc) phép đo được lặp lại 5 lần. Sử dụng máy đo độ dai WDS-1 với tốc độ lưỡi dao 300mm/phút.
Hình 2.5. Máy đo độ dai WDS-1 2.2.6.3. Xác định độ mất nước chế biến
Độ mất nước chế biến được xác định theo phương pháp Bouton và cộng sự (1971).
Cân 10 g mẫu thịt (4 cm x 2 cm x 0,5 cm) và cho vào túi chịu nhiệt. Luộc trong thiết bị water bath (WNB10) ở 95oC trong 3 phút, sau đó làm mát dưới vòi nước chảy 5 phút.
Lấy thịt ra khỏi túi, làm khô bằng khăn gạc mềm và cân khối lượng mẫu. Công thức tính tỷ lệ mất nước chế biến:
TL mất nước chế biến (%) =
m trước chế biến - m sau chế biến
100 m trước chế biến
2.3.7. Phương pháp toán học
Số liệu tính toán bằng bằng chương trình Microsoft Excel và đựơc xử lý bằng phần mềm Minitab 16.2.0.
2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.8.1. Thí nghiệm 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của độ già chín đến hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Sau đó, xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời điểm thu hoạch dịch nhựa.
2.3.8.2. Thí nghiệm 2
Khảo sát lựa chọn dung môi (ethanol 96% và aceton) sử dụng để kết tủa protein trong dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2 (mục 1.3.2, phụ lục 1).
2.3.8.3. Thí nghiệm 3
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nhựa/dung môi kết tủa đến hàm lượng protein và hoạt độ protease. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 3 (mục 1.3.3, phụ lục 1).
2.3.8.4. Thí nghiệm 4
Khảo sát thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ protease.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 4 (mục 1.3.4, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.5. Thí nghiệm 5
Khảo sát nhiệt độ kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ của protease.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 5 (mục 1.3.5, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.6. Thí nghiệm 6
Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26].
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 6 (mục 1.3.6, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.7. Thí nghiệm 7
Phương pháp tiến hành khảo sát pH thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26].
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 7 (mục 1.3.7, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn pH thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.8. Thí nghiệm 8
Phương pháp tiến hành khảo sát độ bền nhiệt độ của enzyme protease [13].
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 8 (mục 1.3.8, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn khoảng nhiệt độ cho độ bền của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.9. Thí nghiệm 9
Phương pháp tiến hành khảo sát khả năng làm mềm thịt bò của chế phẩm ficin.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 9 (mục 1.3.9, phụ lục 1)
Sau đó xác định độ dai, tỷ lệ mất nước của thịt sau khi ướp chế phẩm ficin.