Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.7. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
2.3.7.1. Ly trích
Rễ sau 2 tuần và lá sau 1 tuần nuôi cấy được ly trích qua nhiều giai đoạn (hình 2.5). Kết quả thu được lấy làm sinh trắc nghiệm để đo hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có trong các mẫu trên.
Hình 2. 5. Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (Bùi Trang Việt, 1992)
Mẫu nghiền với methanol 80%
Hòa tan trong 5ml nước cất cô cạn 1 ml
pH 2,5; Ether
Dịch nước
Dịch nước (bỏ) Ether
Sắc ký
Hoạt tính Zeatin
pH 7; Ether Ether
Ether Dịch nước (bỏ)
Hoạt tính IAA, ABA, Gibberellin
NaHCO3 8%
Sắc ký
2.3.7.2. Sắc ký lớp mỏng
Dịch acid và trung tính (trong ether) của các mẫu hoa được chấm trên bản sắc kí lớp mỏng bằng nhôm tráng silica gel 60 F254 (Merck) kích thước 20 x 20 cm. Sử dụng micropipet chấm ether cô cạn và chất chuẩn cách mép 2 cm. Sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy làm khô vị trí này và sau đó tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch ether. Chấm các điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn gồm IAA, ABA và GA3 và zeatin tinh khiết nồng độ 1mg/l cho mỗi chất.
Đặt bản silica gel vào thùng sắc kí, dùng dung môi di chuyển (Isopropanol:
Amon hydroxyd: H2O = 10:1:1 (theo tỉ lệ), nhiệt độ 30 - 32oC). Theo mao dẫn dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc kí, tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bản sắc kí.
Khi mức dung môi cách mép 1cm thì sắc kí kết thúc. Lấy bản sắc kí ra khỏi thùng, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc kí.
2.3.7.3. Phát hiện và cô lập
Vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do được nhận diện bằng các phương pháp đặc trưng rồi so với bản sắc kí chứa dung dịch các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng hỗn hợp.
- IAA khi để khô tự nhiên cho màu nâu vàng.
- ABA cho màu vàng nâu khi phun H2SO4 10%, sấy ở 1300C trong 8 phút.
- Zeatin cho vệt màu xanh khi phun hỗn hợp xanh bromophenol: AgNO31% (tỉ lệ 1:1 theo thể tích).
Ngoài ra, cả IAA, ABA và Zeatin đều có thể được phát hiện trực tiếp dưới tia UV 254 nm.
- Gibberellin được phát hiện khi phun hỗn hợp H2SO4: ethanol (tỉ lệ 5:95 theo thể tích), sấy ở 1100C trong 10 phút và quan sát dưới tia UV.
Các vị trí này tùy thuộc vào hệ dung môi di chuyển và nhiệt độ môi trường khai triển sắc kí.
Trong hệ dung môi trên Gibberellin (Rf = 0,72 - 0,76), auxin (Rf = 0,57 - 0,71), ABA (Rf = 0,78 - 0,85), zeatin (Rf = 0,92 - 0,96). Các chất chuẩn, hỗn hợp các chất nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo lấy các hạt silic từng vùng trên bản sắc kí vào các ống nghiệm nhỏ để chuẩn bị giải hấp.
2.3.7.4. Sự giải hấp
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau khi được cô lập vào các hạt silic trên bảng sắc kí có thể tách rời và hòa tan tốt trong dung môi.
Dung môi chuẩn bị cho quá trình giải hấp gồm có methanol: chloroform (tỉ lệ 8 : 2 theo thể tích), sau đó cứ 100 ml hỗn hợp cho thêm vào 3 ml dung dịch acid acetic. Trộn đều dung môi giải hấp này trước khi sử dụng.
Thêm 3 ml dung môi giải hấp vào ống nghiệm đã chứa các hạt silic ở trên và vortex 3 phút. Li tâm với vận tốc 1.500 vòng/phút (trong 3 phút). Dịch nổi sau hai lần giải hấp của mỗi chất được cho vào đĩa Petri hoặc Erlen 100 ml và cô cạn, sau đó thêm 10 ml nước cất và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các chất vào dung dich để chuẩn bị sinh trắc nghiệm.
2.3.7.5. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng sinh trắc nghiệm
Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở vật liệu sau khi ly trích và phân đoạn qua sắc kí bản mỏng, gồm các chất trích từ mẫu lá và rễ tràm ở 10 băng trên bản mỏng silica gel.
Hoạt tính Acid abscisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt, 1992; Nguyen Thi Ngoc Lang, 1970). Hột lúa gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 310C ± 20C và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính IAA tỷ lệ thuận với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong IAA
tinh khiết 1 mg/l, hoạt tính ABA tỷ lệ nghịch với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong ABA tinh khiết 1 mg/l.
Hoạt tính gibberellin (GA3) được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hột xà lách trên bông ẩm, nhiệt độ 310C ± 20C sau 18 giờ chọn hột có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ đặt trong các Becher nhỏ (100 ml) chứa dịch trích sau sắc ký. Các Becher được đặt dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 280C ± 20C. Sau 72 giờ, đo sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn (nước cất). Hàm lượng gibberelline tỷ lệ thuận với chiều dài trụ hạ diệp trong GA3 tinh khiết 10 mg/l.
Hoạt tính zeatin được đo dựa trên sự tăng trọng lượng của tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.). Hột dưa leo gieo trong tối, trên bông ẩm, ở nhiệt độ 310C
± 20C. Khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hột, thu các tử diệp, cân 10 tử diệp và đặt trên giấy thấm ẩm chứa dịch trích cytokinin ở 280C ± 20C, ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux. Sau 48 giờ, đo và tính sai biệt trọng lượng tử diệp so với chuẩn (nước cất). Hoạt tính zeatin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa leo so với chuẩn nước cất và zeatin tinh khiết 1 mg/l.