Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số đặc điểm sinh học của Gõ đỏ
3.1.3. Đặc điểm mã vạch ADN cho nguồn gen Gõ đỏ tại Hoại Nhang
3.1.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
ADN được tách chiết theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof et al., 1984 đã chứng tỏ là một quy trình có hiệu quả để phân lập ADN thực vật.
Cách tiếp cận này là phổ biến đối với chiết xuất ADN từ các loài thực vật có chứa hàm lượng cao polysaccharide, cũng như các hợp chất polyphenol, tannin, flavonoid (Ghaffariyan et al., 2012).
Hình 3.7. Điện di đồ ADN tổng số từ 09 mẫu nghiên cứu trên gel agarose 0,8%
Trong nghiên cứu này, ADN cũng được chiết xuất thành công từ tất cả các mẫu nghiên cứu (Hình 3.7). Băng ADN thu được tương đối gọn, tập trung phía trên đầu giếng và cũng không xuất hiện vệt sáng trong giếng của bản gel agarose 0,8%. Những đặc điểm này chứng minh rằng ADN tổng số thu được có kích thước lớn, không lẫn protein, đủ điều kiện làm ADN khuôn cho nhân bản ba đoạn mã vạch ADN đề xuất, đặc biệt khi tất cả các đoạn mã vạch ADN này đều nằm ở vùng ADN lục lạp.
3.1.3.2. Kết quả khuyếch đại PCR và đọc trình tự gen
Thành công của khuyếch đại PCR cùng xác định được trình tự là một tiêu chí quan trong để đánh giá tính hữu ích của mã vạch ADN. Trong nghiên cứu này, ba đoạn mã vạch đề xuất matK, rbcL và psbA-trnH được khuyếch đại bằng việc sử dụng các cặp mồi phổ quát cùng các thành phần và quy trình PCR được tối ưu hóa cho từng đoạn mã vạch. Tất cả các đoạn mã vạch ADN thuộc vùng ADN lục lạp đều được khuyếch đại thành công ở tất cả 09 mẫu nghiên cứu.
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm PCR của matK (a), rbcL (b), psbA-trnH (c) Ghi chú: M: Thang ADN, 1: đối chứng dương, 2: đối chứng âm, 3-11:
tương ứng với các mẫu AxL11, AxL12, AxL13, AxL21, AxL22, AxL23, AxL31, AxL32 và AxL33
Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là 100%.
Tỷ lệ thành công trình tự hai chiều đạt được từ sản phẩm PCR là 100% cho ba đoạn mã vạch ADN (Bảng 3.6). Kết quả này một lần nữa khẳng định chất lượng của ADN được tách chiết, hàm lượng và kích thước đủ lớn cũng như không lẫn các tạp chất (polysaccharide, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân dòng PCR. Hơn nữa, sản phẩm PCR đặc hiệu của cả ba đoạn mã vạch ở tất cả các mẫu nghiên cứu chứng tỏ sự hiệu quả trong tối ưu hóa thiết kế mồi và quy trình PCR.
Bảng 3.6. Đánh giá ba vùng ADN lục lạp đề xuất
Chỉ tiêu phân tích matK rbcL psbA- trnH
Các mã số trình tự nucleotide trên GenBank được lựa chọn để so sánh Tỷ lệ PCR thành công (%) 100 100 100 KC627920.1;
KC627867.1;
KC627408.1;
EU361848.1; JF270629.1;
EU361848.1; JX518045.1;
KU748262.1;
EU361847.1;
KC628648.1;
KC628574.1;
KC627950.1;
KU748208.1; JF265273.1;
JX572247.1; KJ735963.1;
KC668118.1 và KC667571.1.
Tỷ lệ đọc trình tự thành
công (%) 100 100 100
Chiều dài trình tự (bp) 889 599 445
Vị trí sai khác 3 2 1
Số nucleotide sai khác 3 2 1
Sự phân biệt mức độ loài
(%) 0,34 0,33 0,22
3.1.3.3. Kết quả phân tích dữ liệu ADN mã vạch
Với cách lựa chọn ba mẫu Gõ đỏ cùng ba lần lặp lại ở mỗi mẫu, tổng cộng thu được 27 trình tự nucleotide cho ba đoạn mã vạch ADN đề xuất. Chất lượng trình tự nucleotide là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ đọc thành công là 100%. Các trình tự này sau đó được chỉnh sửa và ghép nối bằng tay và phần mềm Bioedit version 7.2.5. Kết quả trình tự nucleotide phân tích thuộc vùng ADN lục lạp lần lượt là 889 bp, 599 bp và 445 bp cho matK, rbcL và psbA- trnH (Hình 3.9). Tiếp theo, trình tự nucleotide của từng đoạn mã vạch được
so sánh trực tiếp với cùng loại mã vạch ADN ở cùng loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib) hoặc cùng chi Afzelia trên Cơ sở dữ liệu mã vạch ADN (BOLD- Barcode of Life Data Systems), Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Hoa Kỳ (NCBI-National Center for Biotechnology Information) bằng công cụ BLAST (có sẵn tài địa chỉ website:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm ClustalW2 (có sẵn tại địa chỉ website: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Với đoạn mã vạch matK, hiện chi Afzelia có 09 trình tự trên NCBI: Afzelia bella (04):
KC627920.1; KC627867.1; KC627408.1 và EU361848.1); Afzelia quanzensis (04): JF270629.1; EU361848.1; JX518045.1 và KU748262.1;
Afzelia bipindensis (01): EU361847.1; Bằng phần mềm Bioedit, trình tự nucleotide của matK từ loài Gõ đỏ được so sánh với cùng loại mã vạch matK từ 09 loài thuộc chi Afzelia. Điểm bắt đầu so sánh ở vị trí nucleotide thứ 450, kết quả chỉ ra 03 nucleotide sai khác ở 03 vị trí , trong đó 02 vị trí (nucleotide thứ 609 thay T bằng A và nucleotide thứ 1052 thay C bằng T) xuất hiện ở loài Afzelia quanzensis (EU361848.1) và 01 vị trí (C thay bằng A ở vị trí nucleotide 1235) xuất hiện trong loài nghiên cứu so với 9 loài trên GenBank.
Hình 3.9. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng matK
Tương tự với đoạn mã vạch rbcL, có 07 trình tự trên NCBI: Afzelia bella (03): KC628648.1; KC628574.1 và KC627950.1; Afzelia quanzensis (03):
KU748208.1; JF265273.1 và JX572247.1; Afzelia africana (01): KJ735963.1;
Trình tự nucleotide của rbcL khi được so sánh chỉ ra 02 nucleotide sai khác ở 02 vị trí tại loài Afzelia quanzensis. Trong khi, với đoạn mã vạch psbA-trnH, chi Afzelia có 02 trình tự trên NCBI, đều thuộc về loài Afzelia bella (KC668118.1 và KC667571.1). Kết quả so sánh chỉ ra 01 nucleotide sai khác ở 01 vị trí.
Từ kết quả phân tích BLAST và ClustalW2 nêu trên, khả năng phân biệt ở mức độ loài của ba đoạn mã vạch đề xuất là: matK > rbcL > psbA-trnH.
Trong đó, hai mã vạch matK và rbcL là khác nhau không nhiều. Kết quả này trùng hợp với khuyến cáo của CBOL (2009), khi cho rằng chỉ sử dụng hai mã vạch ADN cho nhận biết thực vật bậc cao là rbcL và matK.