CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Điều tra tình hình chăn nuôi vịt trên địa bàn toàn huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi với tổng đàn vịt, tổng đàn tại thời điểm điều tra;
- Đánh giá tỷ lệ bệnh tiêu chảy do nghi nhiễm khuẫn Salmonella và tiến hành lấy mẫu. Mẫu được lấy ở các ổ bệnh nghi nghiễm Salmonella được điều tra. Mẫu được lấy nhẫu nhiên trên địa bàn toàn huyện.
- Tiến hành thu mẫu thu thập mẫu lách và tim từ những con vịt bệnh hoặc chết do nghi nhiễm vi khuẩn Salmonella. Mổ khám lấy mẫu lách. Theo Quinn và cs (2002):
“Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non và kết tràng, chúng nhanh chóng đi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, ở đây chúng sản sinh độc tố làm tổn thương gan và lách…”.
Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mẫu lách để làm bệnh phẩm nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella.
- Bảo quản mẫu ở -200C cho đến khi phân tích nếu không được xét nghiệm ngay. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông, thì có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 - 40C nhưng không được quá 36 giờ (mẫu không có giá trị khi được lấy từ vịt đã chết quá 3 giờ, vi sinh vật đường ruột xâm nhập vào phủ tạng gây tạp nhiễm sau khi chết).
- Sau khi lấy mẫu và xử lý mẫu xong thì tiến hành lưu mẫu và gửi mẫu. Mẫu được giử về nghiệm phòng Vi trùng - Truyền nhiễm - Khoa chăn nuôi - Thú y; Đại học Nông Lâm Huế để bảo quản và tiến hành phân lập.
2.2.3.2. Phương pháp phân lập phát hiện vi khuẩn Salmonella
Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn theo phương pháp phân lập vi khuẩn thường quy. Sử dụng môi trường đặc hiệu thạch đĩa SS, chọn những khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc tròn, rìa đều có màu đen)
Xử lý mẫu đối với mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ phòng.
- Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Salmonella được phân lập theo quy chuẩn ISO 6579:2002, có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Mẫu phân sau khi xử lý được nuôi cấy, phân lập theo sơ đồ.
Bước 1 Vi khuẩn sau khi nuôi tăng sinh trong môi trường tiền tăng sinh BPW, ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Sau đó đọc kết quả.
Bước 2: Phân lập vi khuẩn bằng cách cấy dích dắc (cấy 3 pha) lên môi trường SS, ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Sau đó đọc kết quả.
2.2.3.3. Kiểm tra hình thái và đặc điểm sinh học vi khuẩn phân lập được Nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu SS agar, XLD và BHJ.
Kiểm tra khả năng thích nghi của chủng vi khuẩn phân lập được khi môi trường thay đổi với mức nhiệt từ 02 – 100 0c.
Làm tiêu bản, nhuộm màu Gram, sau đó sử dụng kính hiển vi quang học với vật kính dầu để kiểm tra hình thái vi khuẩn phân lập được. Cách nhuộm Gram. Theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006).
Bước 1: Nhỏ dung dịch tím kết tinh lên tiêu bản để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy nước đi.
Bước 3: Tẩy màu bằng cồn nguyên chất hoặc cồn axeton từ đầu phiến kính, nghiêng phiến khính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 4: Nhuộm bổ sung dung dịch fucsin loãng để 1 phút, rửa nước, vẩy khô nước. Thấm khô phiến kính, xem dưới vật kính dầu × 100. Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
37ºC,24h
37ºC,24h
37ºC,24h
37ºC,24h
37ºC,24h
37ºC,24h
Mẫu bệnh phẩm
Tiền tăng sinh
Môi trường phân lập Salmonella ( SS-agar) Tăng sinh chọn lọc
Cấy thuần
Phản ứng sinh hóa (Citrat, MUI, MR, Lactose, Glucose, Saccharose)
Giữ giống
Thử nghiệm kháng sinh đồ
Kiểm tra độc lực trên chuột, vịt con
Điều trị thử nghiệm
2.2.3.4. Kiểm tra đặc tính sinh học của vi khuẩn phân lập được
Sử dụng dãy sinh hóa ngắn để xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella phân lập được (Như khả năng lên men đường Lactose, Glucose và saccharo, sinh H2S, sinh Gas, Urease, Indol, methylred ).
Tiến hành xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella trên 7 môi trường sinh hóa (Nguyễn Như Thanh, 2006).
• Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Lactose, Glucose, Saccharose
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ ống canh thang, cấy vào các ống môi trường chứa Lactose, Glucose, Saccharose. Để tủ ấm 370C trong vòng 18 – 24 giờ.
Đọc kêt quả.
Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường thì môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, kết quả dương tính. Ngược lại môi trường không đổi màu, kết quả âm tính.
• Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Dùng que cấy vô trùng vi khuẩn cần kiểm tra ria đều trên phần thạch nghiêng và cấy chích sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 37°C sau 18 – 24 giờ thì đọc kết quả. Trong môi trường KIA cho phép xác định được 4 tính chất:
- Khả năng lên men đường Glucose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đứng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng là dương tính và ngược lại, vi khuẩn không có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đúng giữ nguyên màu đỏ là âm tính.
- Khả năng lên men đường Lactose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sẽ làm phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng là dương tính, ngược lại màu hồng là âm tính.
- Khả năng sinh hơi: Vi khuẩn cso khả năng sinh hơi làm thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên khỏi đáy ống nghiệm, trong trường hợp sinh hơi yếu thì trong lòng thạch có các bọt khí.
- Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sản sinh H2S thì phần thạch đứng có màu đen. Do H2S được hình thành từ các acid amin chứa lưu huỳnh có trong peptone hoặc từ các Sodium thiosulphate (Na2S2O3) có trong môi trường. H2S phản ứng với FeSO4 (Ferrous Ammonium sulphate) theo phản ứng sau:
H2S + FeSO4= FeS (đen) + H2SO4
• Kiểm tra sinh hóa trên môi trường MUI
- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần kiểm tra cấy một đường chọc sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 370C trong 18 – 24 giờ sau đó đọc kết quả. Môi trường này cho phép xác định 3 tính chất:
- Khả năng di động: Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy.
- Vi khuẩn có enzyme urease sẽ phân giải urê thành NH3 và làm pH của môi trường thay đổi, khi đó chất chỉ thị màu Phenol red chuyển môi trường sang màu cánh sen.
- Tiến hành thử Indol: Trong môi trường MUI có chứa tryptophan là một amino acid, một số vi khuẩn có men Tryptophanaza phân giải Tryptophan sinh Indol. Khi nhỏ thuốc thử Kovac vào môi trường Urease – Indol có cấy vi khuẩn có khả năng phân giải tryptophan sinh Indol thì trên bề mặt môi trường sẽ xuất hiện vòng màu đỏ.
• Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Citrat
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc thuần khiết ria đều trên phần thạch nghiêng, để tủ ấm 37oC sau 16 - 24 giờ thì đọc kết quả. Môi trường CIT có màu xanh lá cây, vi khuẩn có khả năng sử dụng hydrocarbon làm kiềm hóa môi trường nên phản ứng dương tính môi trường CIT chuyển thành màu xanh nước biển, âm tính môi trường không đổi màu.
• Kiểm tra sinh hóa trên môi trường MR – VP
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc thuần khiết cho vào ống MR, để tủ ấm 37oC sau 18-24 giờ đọc kết quả. Dung thuốc thử methyl red cho vào ông nghiệm nếu tạo thành vòng màu đỏ thì MR dương tính, ngược lại thuốc thử bị mất màu là âm tính..
2.2.3.5. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được
Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy chuyển vào môi trường BHI. Canh trùng được bồi dưỡng ở 370/24 giờ.
Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 con chuột nhắt trắng khỏe mạnh(trọng lượng 18-20 g/con) và 2 vịt con khỏe mạnh, với liều tiêm 0,2 ml/con vào xoang phúc mạc. Lô đối chứng gồm 2 chuột và 2 vịt con được tiêm nước muối sinh lý với liều tiêm và đường tiêm tương tự.
Bước 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết, số lượng chuột chết, vịt con chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, vịt con chết, giờ chuột chết, vịt con chết bình quân để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
2.2.3.6. Xác định tính mẩn cảm với kháng sinh
- Xác định tính mẩn cảm với kháng sinh với một số chủng Salmonella có độc lực cao bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy kháng sinh trên thạch. Sử dụng các đĩa giấy tẩm kháng sinh công ty Nam Khoa sản xuất để đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch.
- Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn đã được chuẩn bị trước. Trải đều vi khuẩn trên mặt thạch thường, để khô. Dùng kẹp vô trùng đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh trên mặt thạch sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy là 2-2,5 cm và một khoanh ở trung tâm. Mỗi đĩa thạch đường kính 9 cm có thểđặt được 6 khoanh giấy. Dùng kẹp vô trùng đặt khoanh giấy nhẹ nhàng, rồi khẽ ấn giấy xuống đảm bảo hoàn toàn khoanh giấy tiếp xúc với mặt thạch, không chuyển dịch khoanh giấy nếu như nó đã tiếp xúc với mặt thạch. Để úp các đĩa thạch vào tủ ấm ở 370C. Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh bảng tiêu chuẩn để tính độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của vi khuẩn.
2.2.3.7. Điều trị thử nghiệm
- Trên cơ sở nghiêm cứu, đặc tính của bệnh trên địa bàn huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi và kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với kháng sinh đã được kiểm tra tính mẫn cảm là Cefotaxime và Rafampin thì Tôi chọn Cefotaxime để thực hiện điều trị thử nghiệm
- Điều trị tại cơ sở
+ Lô 1: 48 con điều trị bằng phác đồ 1 + Lô 2: 47 con điều trị bằng phác đồ 2
( Vịt của ông Nguyễn Xuân Hùng xã Tịnh Hiệp, huyện Sơn Tịnh với 95 con) + Lô 3: 38 con điều trị bằng phác đồ 1
+ Lô 4: 50 con điều trị bằng phác đồ 2
(Vịt của ông Lê Ngọc Mai xã Tịnh Hà, huyện Sơn Tịnh với 88 con).
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học sử dụng phần mềm EXCEL/2010 và phần mềm Epicalc 2000.
Số vịt bệnh điều tra
+ Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100
Tổng đàn điều tra
Số mẫu dương tính
+ Tỷ lệ phân lập (%) = x 100
Số mẫu kiểm tra
+ Tính sự sai khác trong điều trị thử nghiệm xử dụng phần mềm Epicalc 2000
CHƯƠNG 3