- Từ các chủng vi khuẩn vi khuẩn phân lập được lấy ngẫu nhiên mỗi xã 2 chủng. Tiến hành nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng BHI ở 370C. Sau từ 5 - 24 giờ tiêm cho chuột nhắt trắng với liều tiêm 0,2ml/con vào xoang bụng. Mỗi chủng thử trên 2 chuột. Sau khi tiêm tiến hành theo dõi trong vòng 72h, chuột chết tiến hành mổ khám, thu máu tim, phân lập lại vi khuẩn. 02 chuột đối chứng với nước muối sinh lý chuột không chết. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kiểm tra kết quả độc lực của chủng Salmonella phân lập được trên chuột
Chủng
Liều tiêm (ml)
Vị trí tiêm
Số chuột
tiêm
Thời gian chết (Giờ)
Số chuột
chết Kết quả phân lập 8 - 12 13 - 24 Tổng lại
số
Tỷ lệ (%)
S3 0,2
Xoang phúc
mạc
2 1 1 2 100 +
S25 0,2 2 2 0 2 100 +
S33 0,2 2 1 1 2 100 +
S40 0,2 2 0 2 2 50 +
S70 0,2 2 2 0 2 100 +
S79 0,2 2 2 0 2 100 +
S100 0,2 2 0 2 2 100 +
S112 0,2 2 2 0 2 100 +
Nước muối
sinh lý 0,2 2 0 0 0 0 -
- Bệnh tích của chuột sau khi chết có biểu hiện chung là: Viêm ruột, niêm mạc ruột xung huyết, xoang bụng chướng hơi, thủy thũng, gan, thận sưng, tụ máu. Phân lập lại vi khuẩn từ chuột chết cho thấy 100% các trường hợp đều thấy sự có mặt của vi khuẩn Salmonella. Trong nghiên cứu của chúng tôi tất cả các chuột thử nghiệm đều chết (16/16) trong vòng 24 giờ sau khi tiêm. Kết quả này tương tự nghiên cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2003). Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997); Cù Hữu Phú và Cs (2000) và Nguyễn Quang Tuyên (1996).
3.6. XÁC ĐỊNH TÍNH MẨN CẢM VỚI KHÁNG SINH VỚI MỘT SỐ CHỦNG SALMONELLA
Để xác định mức độ mẫn cảm với thuốc kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được chúng tôi tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp của Quin và cs (1994).
- Khoa học, y học càng ngày càng tiến bộ, nhiều loại thuốc kháng sinh đã được nghiên cứu, phát hiện và sản xuất theo những cách khác nhau. Mặc dù việc sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên việc dùng thuốc kháng sinh không đúng cách, không đúng liều lượng, liệu trình và kết hợp nhiều loại thuốc kháng sinh cũng đã tạo nên hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn và đó đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội.
- Vi khuẩn đề kháng thuốc kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn đề kháng với hầu hết thuốc kháng sinh dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng thuốc kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác.
- Vi khuẩnSalmonella, bệnh do vi khuẩn Salmonella vây ra cũng không ngoại lệ nhiều loại thuốc kháng sinh đã không còn tác dụng với vi khuẩn này. Vì vậy, trong chẩn đoán thường dùng phương pháp kháng sinh đồ để tìm loại thuốc kháng sinh phù hợp nhằm mục đích điều trị đạt hiệu quả cao mà ít tốn kém, thay vì việc tự chọn một loại thuốc kháng sinh bất kỳ trong một lần điều trị sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với kháng sinh.
- Nguyên lý của phương pháp: Các khoanh giấy đã tẩm kháng sinh đặt lên mặt thạch đã được dàn đều một lớp vi khuẩn cần kiểm tra. Kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch tạo một gradien nồng độ, để tủ ấm 37oC/24 giờ. Đánh giá kết quả qua đường kính vô khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Môi trường Muller Hinton Agar
+ Bộ đĩa giấy các loại kháng sinh thông dụng: Tetracycline, Gentamicin, Cephalexin, Kanamycin, Neomycin, Colistin, Cefotaxime, Ampicilin, Steptomycin, Rafampin.
+ Canh khuẩn đã nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu ở 370C từ 2-8 giờ.
- Tiến hành: Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn đã nuôi cấy. Trải đều vi khuẩn trên mặt thạch thường, để khô. Dùng kẹp vô trùng đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh trên mặt thạch sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy là 2-2,5 cm
và một khoanh ở trung tâm. Mỗi đĩa thạch đường kính 9 cm có thể đặt được 6 khoanh giấy. Dùng kẹp vô trùng đặt khoanh giấy nhẹ nhàng,rồi khẽ ấn giấy xuống đảm bảo hoàn toàn khoanh giấy tiếp xúc với mặt thạch, không chuyển dịch khoanh giấy nếu như nó đã tiếp xúc với mặt thạch. Để úp các đĩa thạch vào tủ ấm ở 370C. Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh bảng chuẩn để tính độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của vi khuẩn.
- Nhận định kết quả: Đường kính vòng ức chế được đo bằng thước, đo từ phía mặt sau của đĩa. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét phải đọc khu vực ức chế xấp xỉ 80% của sự ức chế. Nếu những khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
Bảng 3.6.Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của Salmonella
Stt Loại
kháng sinh Kí hiệu
Tổng số mẫu kiểm tra
Tiêu chuẩn
(mm)
Kết quả
Kháng Mẫn cảm
Số mẫu
Tỷ lệ
% Số mẫu Tỷ lệ
%
1 Tetracycline Te 8 18-25 7 87,5 1 12,5
2 Gentamycin Ge 8 19-26 5 62,5 3 37,5
3 Cephalexin Cp 8 15-21 4 50 4 50
4 Kanamycin Kn 8 17-25 5 62,5 3 37,5
5 Neomycin Ne 8 17-23 7 87,5 1 12,5
6 Colistin Co 8 11-17 5 62,5 3 37,5
7 Cefotaxime Ct 8 29-35 2 25 6 75
8 Ampicilin Am 8 16-22 5 62,5 3 37,5
9 Streptomycin Sm 8 12-20 6 75 2 25
10 Rifampicin Rf 8 8-10 2 25 6 75
Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella được thể hiện qua bảng 3.7, kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Salmonella phân lập được có khả năng kháng lại với một số thuốc kháng sinh với tỷ lệ kháng cao: 87,5% chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đề kháng với Tetracycline và Neomycin. Trong khi đó chúng mẫn cảm cao với Cefotaxime và Rifampicin với tỷ lệ mẫn cảm 75%, mẫn cảm trung bình với Gentamycin, Colistin, Kanamycin, Ampicilin, Streptomycin, Cephalexin từ 37,5%-50%.
Theo nghiên cứu của Tô Liên Thu (2004) các chủng Salmonella phân lập được đề kháng cao (>60%) với các loại kháng sinh thông thường như Tetracylin, Ampicilin, Streptomycin, Chloramphenicol, Doxycylin. Các loại kháng sinh Neomycin, Gentamycin, Norfloxacin, có mức kháng thuốc thấp hơn (<15%) đối với các chủng Salmonella.
Nguyễn Thị Chinh và cs (2010) cho biết các chủng Salmonella mẫm cảm mạnh với Norfloxacin, Ciprofloxacin và Ofloxacin, kháng mạnh với Gentamicin, Ampicillin.
Một nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh Hoàng và cs (2015) cho kết quả: tất cả 48 chủng Salmonella spp. kháng kháng sinh, có 21 chủng kháng tetracyline, chiếm tỷ lệ cao nhất 43,75%; 13 chủng kháng Ampicillin chiếm 27,08%. Tỷ lệ các chủng kháng với Ofloxacin, Ceftriaxone và Ceftazidime tương đối thấp, lần lượt là 6,25%, 6,25% và 4,16%.
Tương tự như nghiên cứu nêu trên, các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt Nam thực hiện nghiên cứu về sự lan tràn các chủng Salmonella kháng kháng sinh ở thịt heo và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh khá cao mà cụ thể là kháng Tetracycline (54,5%), Streptomycin (41,5%), Chloramphenicol (35,6%), và Ampicillin (33,1%) (Thai T. H., Yamaguchi R., 2012).
Bên cạnh đó, nghiên cứu của Vũ Khắc Hùng và cs (04/2015) phân lập Salmonella từ những vịt tiêu chảy cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh rất cao: 100 % với Ampicillin; 88,89 % với Chloramphenicol và 66,67 % với Bactrim.
So sánh kết quả mà chúng tôi có được với kết quả của một số tác giả nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella ta thấy khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella là khá phổ biến, tính kháng thuốc này ở mỗi nơi, mỗi thời điểm có sự khác nhau nhưng đều có chiều hướng tăng lên về tỷ lệ và chủng loại thuốc kháng sinh
Việc lạm dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho động vật nói chung đang là một vấn đề nan giải ở nước ta, gây ra không ít khó khăn cho ngành thú y và cả nhân y. Vì yếu tố kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Salmonella luôn luôn thay đổi theo thời gian, không gian khác nhau ở từng cá thể. Vì vậy, ở mỗi thời điểm nhất định, cần phải làm kháng sinh đồ để xác định chính xác khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh.
3.7. ĐIỀU TRỊ THỬ NGHIỆM
Từ kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh chúng tôi chọn Cefotaxime và Ceftiofur là những kháng sinh hiện đang có trên thị trường chỉ định điều trị nhiễm khuẩn Gram âm, cả hai loại kháng sinh này điều thuộc nhóm Cephalosporin. Chúng tôi bố trí thí nghiệm điều trị vịt có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nghi do vi khuẩn Salmonella gây ra với hai phác đồ điều trị như sau:
• Phác đồ điều trị 1
- Kháng sinh Cefotaxime Sodium tiêm 0,5ml/con/ngày.
- Bcomlex C bổ sung qua nước uống theo nhu cầu.
• Phác đồ điều trị 2
- Kháng sinh Ceftiofur Sodium tiêm 0,5ml/con/ngày.
- Bcomplexbổ sung qua nước uống theo nhu cầu Trong 02 phác đồ điều có:
- Bcomplexdùng bổ sung vào thực ăn hay nước uống trong thành phần có chứa các loại kháng: NaCl; KCl; NaHCO3 …có tác dụng bổ sung chất điện giải như: Na+ ; K+; Cl-; HNO3-… có tác dụng chống mất nước, giải nhiệt, giải độc gan, kích thích thèm ăn.
Bảng 3.7. Kết quả điều trị thử nghiệm
Lô thí nghiệm
Số lượng
(con)
Kháng sinh sử dụng
Phác đồ điều trị
Hiệu quả điều trị Số con khỏi triệu chứng bệnh Sau 2
ngày
Sau 3 ngày
Tổng số (Con)
Tỷ lệ (%) Lô 1 48 Cefotaxime
Sodium - Phác đồ 1 29 12 41/48 85,5 Lô 2 47 Ceftiofur
Sodium - Phác đồ 2 36 06 42/47 89,4 Lô 3 38 Cefotaxime
Sodium Phác đồ 1 29 04 33/38 86,9
Lô 4 50 Ceftiofur
Sodium - Phác đồ 2 42 02 44/50 88,0 Lô 1, 2 bố trí tại trại vịtcủa ông Nguyễn Xuân Hùng xã Tịnh Hiệp, huyện Sơn Tịnh với 95 con.
+ Lô 1: 48 con điều trị bằng phác đồ 1 + Lô 2: 47 con điều trị bằng phác đồ 2
Lô 3, 4 bố trí điều trị tại trại của ông Lê Ngọc Mai xã Tịnh Hà, huyện Sơn Tịnh với 88 con.
+ Lô 3: 38 con điều trị bằng phác đồ 1 + Lô 4: 50 con điều trị bằng phác đồ 2
Hai phác đồ trên nhằm so sánh tác dụng điều của hai loại kháng sinh Ceftiofur, Cefotaxime. Kết quả điều trị cho thấy, với nhóm điều trị sử dụng Cefotaxime số con điều trị 86 con, số con khỏi bệnh 74 con, tỷ lệ khỏi bệnh 86,04%.
Nhóm điều trị sử dụng Ceftiofur số con điều trị 97 con, số con khỏi bệnh 86 con, tỷ lệ khỏi bệnh 88,66%.
Như vậy hiệu quả điều trị của hai loại kháng sinh trên có sự sai khác về tỷ lệ.
Tuy nhiên sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05).
Trong thực tế khi phát hiện vịt bệnh tiêu chảy do nghi nhiễm Salmonella chúng tôi tiến hành tiêm kháng sinh để điều trị và bổ sung các chất điện giải theo nhu cầu của vịt qua nước uống. Qua theo dõi, hầu hết vịt có biểu hiện giảm và khỏi triệu chứng lâm sàng sau khi tiêm kháng sinh 2 ngày. Với phác đồ điều trị Cefotaxime sau 2 ngày tỷ lệ khỏi bệnh là 67,44% (58/86), trong khi với Ceftiofur tỷ lệ khỏi là 80,41% (78/97).
Như vậy có sự sai khác về thời gian khỏi bệnh khi sử dụng hai loại kháng sinh trên và sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05).
Căn cứ trên kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của kháng sinh và kết quả điều trị thử nghiệm trên vịt bệnh ta có thể khuyến cáo người chăn nuôi vịt trên địa bàn huyện Sơn Tịnh nên sử dụng kháng sinh Cefotaxime, Rifampicin và Ceftiofur để điều trị bệnh do vi khuẩn Salmlnella gây ra.