CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Cỏ rươi lá bắc
Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Cỏ rươi lá bắc đã được phơi sấy khô và bảo quản. Các phương pháp định tính tham khảo trong các tài liệu [6], [4].
➢ Định tính glycosid tim
Lấy 3 g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan trong 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với EtOH 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 mL chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc nếu vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 mL chì acetat vào, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat.
Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp CHCl3 : EtOH tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5 mL), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại dùng để làm các phản ứng định tính:
• Phản ứng Liebermann: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1 mL anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống
19
1 mL H2SO4 đặc. Quan sát, nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 mL EtOH 90%. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%), nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong 0,5 mL EtOH 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprusiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính alcaloid
Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL.
Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL.
Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9 – 10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng:
• Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính.
Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cô đến cắn (cắn toàn phần).
20
➢ Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt: Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5 mL nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to.
Thêm nước cất đến khoảng 10 mL, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
➢ Định tính flavonoid
Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng:
• Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc:
+ Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
21
Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng.
+ Ống 2: trong suốt.
Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL:
+ Ống 1: trong suốt.
+ Ống 2: có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10 mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính acid hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp.
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3
nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính tanin
Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc.
+ Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính.
+ Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính.
+ Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính.
22
➢ Định tính đường khử
Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính acid amin
Hòa tan cắn vào 2 mL nước nóng. Lọc nóng, lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút, nếu thấy xuất hiện màu tím thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính chất béo
Hòa tan cắn vào 2 mL nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2 mL chloroform và 1 mL anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 450, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, nếu thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì phản ứng dương tính.