Máy cô quay chân không thu hồi dung môi Cân phân tích AND HR – 200
Cột sắc ký đường kính 2 – 5,5 cm Giá sắt, kẹp sắt dùng để treo cột
Cốc thủy tinh 50 mL, 100 mL, 200 mL Ly thủy tinh, nắp thủy tinh dùng để giải ly
Ống nhỏ giọt, lọ thủy tinh không màu nhỏ và lớn Bình cầu 500 mL, 250 mL, 50 mL
Ống nghiệm, khay đựng ống nghiệm, ống đong 10 mL, 100 mL Cối và chày, muỗng niken, Becher 50 mL, 100 mL
Quả bóp cao su, phễu, giấy lọc
Bếp điện hồng ngoại dùng để nướng bản mỏng
Kẹp giữ giấy sắc ký, ống thủy tinh mao quản để chấm mẫu 2.2. Hóa chất
Dung môi được sử dụng: Methanol, Ethanol, Ethyl Acetate, Chloroform, n- Hexane.
Thuốc thử giúp hiện các vệt chất hữu cơ trên bản mỏng: H2SO4 10% trong Ethanol.
Silica gel hạt cỡ 0,04 – 0,06 mm đối với pha thường.
Sắc ký bản mỏng tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel F254 hiệu Merck đối với pha thường.
2.3. Nguyên liệu
Mẫu cây Đại cán Bidoup được dùng trong thí nghiệm được thu hái tại Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, Miền Nam Việt Nam và tháng 12 năm 2018.
Mẫu cây sau khi thu hái sẽ tiến hành loại bỏ những phần sâu, hư hỏng, dập nát trước khi rửa sạch và phơi khô. Sau đó mẫu được mang đi sấy khô và nghiền kĩ thành bột mịn.
2.4. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với sắc ký bản mỏng trong việc phân lập các hợp chất
Áp dụng các phương pháp chiết xuất để điều chế cao chiết.
2.4.1. Sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp dùng để tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất, gồm pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh là chất nhồi cột, thường là silica gel, pha động là dung môi, thường đi từ không phân cực đến phân cực hoặc từ phân cực ít đến phân cực nhiều.[16]
Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha động ODS hoặc YMC (30 – 50 àm, FuJsilisa Chemical Ltd).
2.4.1.1. Nhồi cột
Chọn cột phù hợp với cao, làm khô cột và cân silica gel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi cho silica gel với dung môi đó trong 1 cốc thủy tinh. Nhồi một ít bông gòn dưới đáy cột để silica gel không chảy ra ngoài. Sau đó khuyết salica gel trong dung môi rồi rót nhẹ vào cột. Để một cốc thủy tinh nhỏ (50 mL) phía dưới cột, sau khi rót hết silica gel vào thì xả cột để cố định silica gel, rót thêm dung môi vào cột để ổn định hệ.
2.4.1.2. Nạp cao vào cột
Hòa mẫu vào dung môi chạy cột trong cốc thủy tinh lớn 500 mL sau đó dùng một lượng silica gel cho vào cốc thủy tinh để hấp thụ mẫu, trộn mẫu và silica gel cho đến khi được một hỗn hợp khô. Cho hết hỗn hợp đó vào cột và rót dung
môi chạy cột vào. Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu cho một ít bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào.
Sử dụng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng (thuốc thử hiện hình là dung dịch H2SO4 10% trong dung môi ethanol, dung dịch vanillin 2,5% trong dung môi ethanol) đối với các cao phân đoạn để phân lập một số hợp chất.
2.4.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng. Pha động là chất lỏng đi xuyên qua 1 lớp chết hấp thụ trợ (silica gel hay nhôm oxit) Và chất hấp thụ được tráng thành lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng (tấm plastic, tấm kính hay tấm nhôm).
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đền tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%.
2.5. Xác định cấu trúc các hợp chất đã cô lập
• Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết cô lập được bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C, HSQC, HMBC) và phổ khối lượng MS.
• Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy BRUKER AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
• Phổ MS được ghi trên máy Thermo Scientific – MSQ PLUS tại Viện công nghệ hóa học, số 1, Mạc Đĩnh Chi, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP HCM.
• Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại để xác định cấu trúc các hợp chất cô lập được: MS, 1H NMR, 13C NMR, HMBC, HSQC, COSY…