Bột cây Đại cán Bidoup khô (khối lượng 8,0 kg) được chiết kiệt với dung môi ethanol 96 o trong bình thủy tinh được đậy kín trong nhiều giờ với sự hỗ trợ của máy đánh siêu âm (30 ph/lần) và gia nhiệt nhỏ hơn 50oC. Việc này giúp dung môi có thể xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật làm hòa tan các hợp chất hữu cơ tự nhiên có trong cây. Tiến hành đảo bột trong bình nhiều lần để tăng hiệu quả chiết kiệt.
Sau đó tiến hành thu dịch chiết qua giấy lọc, tiếp tục mang dịch chiết đi cô quay để thu hồi dung môi và thu cao chiết. Tiếp tục chiết phần bã bằng dung môi ethanol 96o đến khi dịch chiết trong, việc này giúp hòa tan hoàn toàn các chất còn sót lại trong bã. Các dịch chiết được gom chung cô quay để thu cao ethanol tổng (1,0 kg) và thu hồi dung môi.
Bước tiếp theo, cao Ethanol tổng được thêm một lượng nước cất vừa đủ và tiếp tục chiết lỏng – lỏng với dung môi được sử dụng là n-Hexane, quá trình chiết được tiến hành lặp lại từ 5 đến 7 lần sử dụng kĩ thuật chiết lỏng – lỏng để thu lấy pha n-Hexane phía trên. Dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm kết quả thu được cặn chiết phân đoạn n-Hexane, ký hiệu là MBH (98 g).
Phần cao Ethanol tổng sau khi chiết với dung môi n-Hexane, tiếp tục chiết lỏng – lỏng với dung môi được sử dụng là Ethyl Acetate, quá trình chiết được tiến hành lặp lại từ 5 đến 7 lần sử dụng kĩ thuật chiết lỏng – lỏng để thu lấy pha Ethyl Acetate phía trên. Dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm kết quả thu được cặn chiết phân đoạn Ethyl Acetate, ký hiệu MBE (33 g) và phần dịch nước còn lại, ký hiệu là MBW (850 g).
Sơ đồ 1: Quá trình chiết thu phân đoạn Ethyl Acetate và dịch nước từ mẫu cây Đại cán Bidoup
Cao n-Hexane MBH 98 g
Chiết lỏng – lỏng với Ethyl Acetate Lọc, cô quay thu hồi
dung môi
Thêm nước cất
Chiết lỏng – lỏng với n-Hexane
Dịch n-Hexane Phần dịch
Cao Ethanol toàn phần (1000 g)
Dịch Ethyl Acetate
Dịch nước 850 g
Cao EA MBE 33 g
Lọc, cô quay thu hồi dung môi
Từ cao EA ban đầu phân ra được 5 phân đoạn nhỏ, đặt tên lần lượt như sau:
MBEI (7 g), MBEII (6 g), MBEIII (5 g), MBEIV (6 g), MBEV (7 g).
Sơ đồ 2: Tách các phân đoạn từ cao EA 3.1.1. Khảo sát phân đoạn MBEI
Thực hiện sắc ký cột với phân đoạn MBEI để phân lập các hợp chất với hệ dung môi H: EA tăng dần (40:60, 30:70, 20:80,10:90, 100% EA), kiểm tra bằng cách chấm sắc ký bản mỏng, giải ly bằng hệ cloroform:methanol thích hợp, và sau đó dùng thuốc thử H2SO4 10% nhận biết các vết màu và gom lại, thu được 5 phân đoạn. Kí hiệu các phân đoạn thu được lần lượt từ MBEI.1 đến MBEI.5.
Tiếp tục kiểm tra 5 phân đoạn trên bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với hệ giải ly thích hợp, nhận thấy MBEI.2 có khả năng thích hợp cho việc tách chiết.
Thực hiện sắc ký cột với phân đoạn MBEI.2 thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ MBEI.2.1 đến MBEI.2.5. Kiểm tra 5 phân đoạn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, giải ly bằng hệ cloroform:methanol thích hợp nhận thấy MBEI.2.2 và MBEI.2.3 xuất hiện 2 vết nên quyết định khảo sát MBEI.2.2 và MBEI.2.3.
Phân đoạn MBEI.2.2 và MBEI.2.3 thực hiện sắc ký cột Silica gel với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexane:Ethyl Acetate (40:60, 35:65, 30:70). Theo dõi trên sắc ký bản mỏng, hệ giải ly cloroform:methanol 99:1, khi sắc ký bản mỏng hiện ra những vết sạch thì thu được 2 chất ký hiệu MB01 và MB02.
Cao Ethyl Acetate MBE 33g
MBEI 7g MBEII 6g MBEIII 5g MBEIV 6g MBEV 7g
Sơ đồ 3: Phân lập hợp chất từ phân đoạn MBEI 3.1.2. Khảo sát phân đoạn MBEII
Phân đoạn MBE.II (6,0 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexane – Ethyl Acetate, theo tỉ lệ nhất định. Trong quá trình chạy sắc ký cột, sử dụng sắc ký lớp mỏng, giải ly bằng hệ dung môi cloroform:methanol thích hợp và thuốc thử H2SO4 10% để hiện các vết màu và gom các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu lần lượt MBE.II.1 (0,5 g), MBE.II.2 (1,5 g), MBE.II.3 (2,0 g), MBE.II.4 (1,0 g), MBE.II.5 (1,5 g) và MBE.II.6 (0,5 g).
Phân đoạn nhỏ MBE.II.2 (2,0 g) tiếp tục thực hiện sắp ký cột với hệ n- Hexane – Ethyl Acetate (99-1→70-30, v/v) thu 02 hợp chất tinh khiết, ký hiệu MB03 (20 mg) và MB04 (7 mg).
MBE.I.1 MBE.I.2 MBE.I.3 MBE.I.4 MBE.I.5 MBE.I
(19 g)
MBE.II (8 g)
MBE.III (2 g)
MBE.IV (1 g)
MBE.V (2 g) CC H-EA (40:60, 30:70, 20:80,10:90,
100:0)
Cao MBE 33g
CC H-EA-MeOH (75:25:0, 50:50:0, 25:75:0, 0:100:0, 0:90:10)
CC H-EA (40:60, 35:65, 30:70) MB01 (20 mg)
MB02 (7 mg)
Sơ đồ 4. Phân lập hợp chất từ phân đoạn MBEII
MBE.II.1 MBE.II.2 MBE.II.3 MBE.II.4 MBE.II.5 MBE.II.6
MBE.I MBE.II MBE.III MBE.IV MBE.V
CC H-EA (40:60, 30:70, 20:80,10:90, 100:0) Cao MBE 33g
CC H-EA-MeOH (75:25:0, 50:50:0, 25:75:0, 0:100:0, 0:90:10)
CC H-EA (99-1→70-30, v/v) MB03 (20 mg)
MB04 (7 mg)
3.1.3. Khảo sát phân đoạn MBEIII
Thực hiện sắc ký cột với phân đoạn MBEIII để phân lập các hợp chất với hệ dung môi H: EA tăng dần (40:60, 30:70, 20:80,10:90, 100% Ethyl Acetate), kiểm tra bằng cách chấm sắc ký bản mỏng, giải ly bằng hệ cloroform:methanol thích hợp, và sau đó dùng thuốc thử H2SO4 10% nhận biết các vết màu và gom lại, thu được 4 phân đoạn. Kí hiệu các phân đoạn thu được lần lượt từ MBEIII.1 đến MBEIII.4.
Tiếp tục kiểm tra 4 phân đoạn trên bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với hệ giải ly thích hợp, nhận thấy MBEIII.1 có khả năng thích hợp cho việc tách chiết.
Thực hiện sắc ký cột với phân đoạn MBEIII.1 thu được 4 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ MBEIII.1.1 đến MBEIII.1.4. Kiểm tra 4 phân đoạn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, giải ly bằng hệ cloroform:methanol thích hợp nhận thấy MBEIII.1.3 và MBEIII.1.4 xuất hiện 2 vết nên quyết định khảo sát MBEIII.1.3 và MBEIII.1.4.
Phân đoạn MBEIII.1.3 và MBEIII.1.4 thực hiện sắc ký cột Silica gel với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexane:Ethyl Acetate (40:60, 35:65, 30:70). Theo dõi trên sắc ký bản mỏng, hệ giải ly cloroform:methanol 99:1, khi sắc ký bản mỏng hiện ra những vết sạch thì thu được 2 chất ký hiệu MB05 và MB06.
Sơ đồ 5. Phân lập hợp chất từ phân đoạn MBEIII MBEIII.1
MBE.I (19 g)
MBE.II (8 g)
MBE.III (2 g)
MBE.IV (1 g)
MBE.V (2 g) CC H-EA (40:60, 30:70,
20:80,10:90, 100:0) Cao MBE 33g
CC H-EA-MeOH (75:25:0, 50:50:0, 25:75:0, 0:100:0,
MB05 (20 mg) MB06 (7 mg)
MBEIII.4 MBEIII.3
MBEIII.2