Bước khử trùng mẫu nuôi cấy là rất quan trọng để tạo ra được nguồn vật liệu vô trùng ban đầu. Khâu này được thực hiện thành công thì các bước tiếp theo mới có thể tiến hành được.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng. Đó cũng là môi trường thích hợp cho các loại nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với quá trình phân chia tế bào của thực vật. Nếu môi trường bị nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ trong vòng 3
– 7 ngày toàn bộ môi trường sẽ bị nhiễm, mẫu cấy sẽ chết dần. Vì vậy, để đảm bảo nuôi cấy được thành công thì mẫu phải được vô trùng tuyệt đối.
Trong nuôi cấy mô của đa số cây trồng, khi đưa mẫu từ ngoài vào trong ống nghiệm, người ta thường phải khử trùng mẫu nuôi cấy. Các chất khử trùng thông dụng nhất là oxy già (H2O2), clorua thuỷ ngân (HgCl2), hypochloride calcium (Ca(OCl)2), hypochloride natrium (NaClO) và một số chất kháng sinh
...v.v. Trong đó, HgCl2 có tác dụng diệt các loại khuẩn tốt hơn, H2O2
diệt nấm tốt hơn (Đỗ Năng Vịnh 2002; 2005). Vì vậy, tùy mẫu và điều kiện nuôi cấy để sử dụng chất khử trùng cho phù hợp.
Trong thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của chất khử trùng đến quá trình vào mẫu của cây lan hoàng thảo Vôi Đỏ, chúng tôi tiến hành trên các đối tượng là lá non, đoạn thân và chồi đỉnh được lấy từ cây mẹ trưởng thành được nhập về hoàn toàn sạch bệnh và được khử trùng với chất khử trùng là H2O2 và HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Kết quả khử trùng mẫu được theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ chết là những chỉ tiêu được đánh giá trên môi trường nuôi cấy phục hồi: VW + 30g/l Sucrose + 5,5 g/l Agar + 10% ND + 10% g/l CX + 0,5 g/l AC, pH = 5,8.
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu lá non nuôi cấy
Chất khử trùng được sử dụng là HgCl2, H2O2, đây là những chất khử trùng mạnh và phổ biến, trong đó: HgCl2 có tác dụng diệt các loại khuẩn tốt hơn, H2O2 diệt nấm tốt hơn (Đỗ Năng Vịnh 2002; 2005). Vì vậy, tùy mẫu và điều kiện nuôi trồng để sử dụng chất khử trùng cho phù hợp. Ảnh hưởng của mẫu lá non với chất khử trùng được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Hiệu quả khử trùng của mẫu lá non
Hóa Nồng
chất
H2O2
HgCl2
Kết quả theo dõi cho thấy cả 2 chất khử trùng đều có khả năng tạo mẫu vô trùng, tỷ lệ tạo ra mẫu vô trùng của mỗi chất khử trùng là khác nhau. Trong đó, chất khử trùng H2O2 nồng độ 15% khử trong 10 phút tỷ lệ tạo mẫu vô trùng là 28%, chiếm tỷ lệ cao nhất. Tuy nhiên khi khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% khử trong 15 phút tạo mẫu vô trùng cao nhất đạt 34%, mẫu sau khi khử trùng vẫn còn xanh và sau cấy chuyển nhiều lần không bị nhiễm trở lại. Thí nghiệm cho thấy nên khử trùng bằng HgCl2 0,1% dưới 20 phút mang lại hiệu quả khử trùng tốt hơn, vì nếu nồng độ cao hơn sẽ làm mẫu nuôi cấy chết đồng loạt. Khử trùng bằng H2O2 đối với mẫu non dễ gây nhũn mẫu và thâm đen sau 2 tuần, mẫu ít màu xanh. Vì vậy, đối với mẫu lá non nên khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% khử trong 15 phút.
HgCl2 0.1% / 15 phút HgCl2 0.1% / 20 phút
Hình 4.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng đối với mẫu lá non
4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùngđến hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh nuôi cấy
Chồi đỉnh là vị trí lấy mẫu lý tưởng vì vị trí mẫu sạch vi khuẩn nhất, ngoài ra sức bật chồi của thực vật ở vị trí này rất tốt. Mẫu chồi đỉnh của một số loài lan, đặc biệt là lan hoàng thảo có phản ứng tạo cụm chồi và protocorm rất tốt. Vì vậy, đề tài đã sử dụng các mẫu này để đưa vào nuôi cấy để tạo nguồn vật liệu ban đầu. Kết quả tạo vật liệu vô trùng thông qua các chất khử trùng được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh
Hóa Nồng
chất
H2O2
HgCl2
Kết quả thí nghiệm cho thấy khử trùng mẫu bằng H2O2 hiệu quả không cao chỉ đạt 36% số mẫu sống sau 20 ngày, các mẫu còn lại dễ bị nhiễm khuẩn hoặc thâm nhũn lá non trên đỉnh chồi dẫn đến chết mẫu. Khử trùng bằng HgCl2
tỉ lệ mẫu sống đạt 50% ở nồng độ 0,1% trong 15 phút, tuy nhiên khử trùng 20 phút cho mẫu không bị nhiễm tỷ lệ cũng khá cao nhưng mẫu dễ bị thâm nhũn trên đỉnh sinh trưởng. Vì vậy, thí nghiệm chọn HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian khử trùng 15-dưới 20 phút để tạo mẫu chồi đỉnh vô trùng. Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng những chồi đỉnh có kích thước lớn hơn (khoảng 3 - 5cm) để nuôi cấy, đây là một phương pháp giảm thiểu đáng kể đến sự chết của mẫu và tăng cao khả năng tái sinh nhưng không làm sạch được virus nếu cây bị bệnh.
Vì vậy, chỉ áp dụng được với những cây không bị nhiễm bệnh.
HgCl2 0.1% / 15 phút
HgCl2 0.1% / 20 phút
Hình 4.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng đối với mẫu chồi đỉnh 4.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu đoạn thân
Theo các nghiên cứu truyền thống cho thấy, tốt nhất là lấy mẫu từ đoạn thân bánh tẻ chứa mắt ngủ đang ở thời kỳ sinh trưởng mạnh. Đỉnh sinh trưởng của những cây trưởng thành còn non tốt hơn cây già . Điều kiện sinh trưởng, thời vụ lấy mẫu cũng có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tá s nh của mẫu nuô cấy. Mored (1964) đã sử dụng những chồ đỉnh có kích thước rất nhỏ (0,1mm) để lấy đỉnh s nh trưởng. Phương pháp này có thể tránh được nh ễm v rut kh cây mẹ bị bệnh.Vì vậy, đề tà đã đưa mẫu từ đoạn thân vào nuôi cấy với huy vọng sau một thời gian bật chồi ngủ. Kết quả đưa mẫu từ đoạn thân được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Hiệu quả khử trùng đối với mẫu đoạn thân
Nồng độ Hóa chất
H2O2
HgCl2
H2O2 + HgCl2
Kết quả cho thấy, mẫu đoạn thân sử dụng các chất khử trùng riêng lẻ cho thấy khử bằng HgCl2 0,1% cho hệu quả cao hơn đạt 46,7% so với khử trùng bằng H2O2 15% nhưng hiệu quả không cao bằng mẫu chồi đỉnh. Vì vậy chúng tôi tiến hành phát sinh thêm một thí nghiệm là sự kết hợp giữa hai chất khử trùng là H2O2
15% trong 5 phút và HgCl2 0,1% trong 10 phút, phương pháp mang lại hiệu quả tối ưu nhất với tỷ lệ mẫu đạt lên đến 73,3%,mẫu sống và bật chồi tốt.
Kinh nghiệm khử trùng mẫu chồi lan cho thấy không nên khử trùng mẫu chồi lan bằng H2O2 15% trong 20 phút và HgCl2 0,1% trong 20 phút, bởi vì sau khi khử trùng mặc dù mẫu còn xanh nhưng sau một thời gian mẫu sức sống kém, bị hóa vàng hoặc nâu thâm đen và chết. Hiện tượng này xảy ra có thể mẫu bị ngộ độc chất khử trùng.
4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA MẪU ĐƯA VÀO NUÔI CẤY
Kết quả nghiên cứu khử trùng các nguồn mẫu khác nhau cho thấy các nguồn mẫu khác nhau thì tỉ lệ tạo mẫu vô trùng là khác nhau. Đặc biệt, khả năng và tỉ lệ phát sinh hình thái của mẫu sau này là khác nhau. Vì vậy, thí nghiệm đưa ra bảng so sánh ảnh hưởng của nguồn mẫu đến tỉ lệ sống sót và sinh trưởng của mẫu nuôi cấy vô trùng. Từ đó tìm ra được bộ phận nào của cây là nguồn mẫu đưa vào nuôi cấy in vitro tốt nhất. Kết quả so sánh sinh trưởng in vitro lan hoàng thảo Vôi Đỏ từ các nguồn mẫu khác nhau được thể hiện ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Nguồn mẫu Lá non
Chồi đỉnh
Đoạn thân Đoạn thân (khử kết hợp)
Kết quả quan sát mẫu sau 2 tuần nuôi cấy cho thấy các nguồn mẫu được đưa vào có tỉ lệ sống đạt từ 34 – 73,3%. Trong đó:
Khử trùng mẫu đoạn thân đạt 73,3% mẫu sống, nguyên nhân có thể đoạn thân bánh tẻ của cây đang tuổi phát triển có sức sống tốt kết hợp với phương pháp khử trùng kết hợp H2O2 15% trong 5 phút kết hợn với HgCl2 0,1% trong 10 phút cho kết quả tỉ lệ mẫu sống đạt cao. Các mẫu đưa từ đoạn thân có màu xanh tươi lâu, sau 2 tuần các mắt bắt đầu nhú chồi mới, protocorm. Theo quan sát và tổng hợp ở bảng 4.4 thì mẫu đoạn thân là nguồn mẫu tốt nhất để đưa vào nuôi cấy và phương pháp khử trùng phù hợp cho tỷ lệ mẫu sông cao, có khả năng phát sinh nhiều loại hình thái khác nhau, thời gian nuôi cấy nhanh, đặc biệt nếu lấy được các đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy riêng thì đảm bảo sạch bệnh.
Mẫu chồi đỉnh có tỉ lệ sống chỉ đạt 50%, nguyên nhân có thể mầm bật lên lá non sinh trưởng vượt qua ngưỡng bọc lấy đỉnh sinh trưởng, khi rửa và khử trùng đã không sạch ở các kẽ lá nên tỉ lệ mẫu sống thấp. Mẫu sau 2 tuần có màu xanh nhưng một phần lá bị chết, hồi phục sau vài tháng. Để khắc phục, thí nghiệm đã bóc tách lớp lá chỉ để phần đỉnh sinh trưởng nhưng thời gian phát sinh hình thái và chất lượng mẫu sau phát sinh kém hơn so với đưa mẫu từ đoạn thân.
Mẫu lá non tỉ lệ mẫu sống đạt thấp nhất 34%, nguyên nhân có thể mẫu lá dễ bị chết khi khử trùng thời gian dài và dễ nhiễm khi khử trùng thời gian ngắn. Mẫu lá sau khử trùng có màu xanh nhưng viền lá dễ bị tổn thương, vàng úa và chết, khó phát sinh hình thái.
Như vậy, nguồn mẫu là đoạn thân bánh tẻ được khử trùng bằng H2O2
(15%) trong 5 phút, tráng nước cất và khử trùng bằng HgCl2 (0,1%) trong 10 phút đạt 73,3% mẫu sống và bật chồi tốt.