Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái chủ yếu và đặc điểm phân tử của loài tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) 3.2.3. Nghiên cứu diễn biến phát sinh gây hại của quần thể tuyến trùng gây nốt sưng (Meloidogyne incognita) hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông 3.2.4. Thử nghiệm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của một số chế phẩm bảo vệ thực vật
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng chính hại hồ tiêu tại Đăk Song, Đăk Nông
3.3.1.1. Thu thập mẫu đất và mẫu rễ hồ tiêu
+ Chọn 5 vườn đại diện cho các địa phương sản xuất hồ tiêu tập trung của huyện Đăk Song, Đắk Nông. Mỗi vườn thu 6 cây đại diện với 3 cây khỏe và 3 cây biểu hiện vàng lá. Những vườn ít cây bệnh và cây khỏe có thể lấy đại diện cây khỏe và cây bệnh phục vụ cho phân tích mẫu vùng đó.
+ Thu mẫu rễ và mẫu đất ở dưới tán cây hồ tiêu ở những cây có biểu hiện bệnh vàng lá (chết chậm) và cây khỏe mạnh, ở độ sâu từ 15-20 cm từ mặt đất. Mỗi cây điều tra lấy 3 điểm theo hình tam giác đều, lấy gốc cây làm trung tâm.Mỗi mẫu rễ lấy 20-30 g, mỗi mẫu đất lấy 500 g.
Hình 3.1. Vị trí lấy mẫu
+ Mẫu đất và rễ được giữ trong túi nilon, ghi rõ ngày tháng, địa điểm lấy
mẫu, mẫu mang về phòng thí nghiệm, bảo quản mát trong tủ lạnh ở điều kiện 5-100C để phân tích dần.
+ Địa điểm điều tra: tại Đăk Song, Đăk Nông.
+ Thời gian điều tra: Điều tra 2 lần/năm, thời điểm đầu mùa mưa (tháng 5) và cuối mùa mưa (tháng 9) là thời điểm có thành phần loài phong phú nhất trên vườn hồ tiêu.
3.3.1.2. Tách lọc tuyến trùng
+ Tách tuyến trùng trong đất và rễ theo phương pháp của Kirjanova and Krall, 1969; Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1992.
+ Từ mỗi mẫu thu được, lấy trung bình 5g rễ và 250g đất để tiến hành phân tích, kiểm tra mức độ gây hại và số lượng tuyến trùng ở rễ.
Tách lọc tuyến trùng từ mẫu đất theo phương pháp lọc tĩnh và tách tuyến trùng từ rễ theo phương pháp của Nguyễn Ngọc Châu (2003).
- Lọc tuyến trùng từ đất
Hình 3.2. Phân loại mẫu và tiến hành lọc mẫu đất
Hệ thống lọc tuyến trùng được thiết kế trên cơ sở phương pháp Baermann. Phễu lọc được mô tả như sau: cấu trúc của hệ thống lọc bao gồm 1 phễu thủy tinh đường kính 13,5 cm, cuống phễu dài 8 cm; phần dưới của cuống phễu nối với ống silicon đường kính khoảng 1,5 cm, dài 9,5 cm; phía dưới ống silicon nối với 1 ống tuýp đường kính 1,2 cm, cao 7,5 cm; cốc đựng đất bằng nhựa đường kính 7,6 cm, cao 5 cm đáy cốc là lưới rất mịn đặt trên phễu. Hệ thống lọc đặt trong các giá sắt cao 30 cm và đặt trên mặt đá để tránh rung động.
+ Lắc đều túi mẫu đất, mỗi mẫu lấy ra 250 g cho vào các cốc đựng đất như mô tả ở trên.
+ Làm ẩm đất bằng cách dung bình phun tay phun nhẹ đều lên mặt
+ Cho nước vào phễu, ước lượng mực nước sao cho khi cho cốc chứa đất vào thì lớp nước sẽ ngập bề mặt của đất.
+ Nhẹ nhàng đặt cốc đất vào phễu, bổ sung thêm nước vào phễu nếu cần.
+ Thời gian lọc là 48 giờ.
+ Khi thu mẫu, nhẹ nhàng tháo ống nghiệm ra khỏi ống silicon, ghi nhãn, đậy nắp và giữ trong tủ lạnh.
Cho mẫu tuyến trùng đã lọc vào hộp petri có chia ô. Đặt lên kính hiển vi soi nổi, đếm số lượng theo số lượng bình quân trên ô hoặc đếm toàn bộ
- Lọc tuyến trùng từ rễ
Theo phương pháp xay rễ được mô tả trong “Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ” của Nguyễn Ngọc Châu (2003), gồm các bước:
+ Mẫu rễ rửa sạch, lau khô, mỗi mẫu cân lấy 5 g, dùng kéo cắt nhỏ (chiều dài khoảng 5 mm).
+ Cho mẫu đã cắt vào cối xay sinh tố, cho nước vào vừa đủ ngập lưỡi dao của cối. Xay 10 giây, nghỉ 10 giây, xay 10 giây, nghỉ 5 giây và xay 5 giây.
+ Mở nắp, dùng vòi nước xả vào để những phần rễ đã xay bám vào nắp và thành cối xuống phía đáy cối để thu tuyến trùng. Lọc qua lưới lọc để loài bỏ những phần gỗ và cặn bã thô.Xả nước mạnh để phần tuyến trựng trong rõy thụ này xuống dưới.Sau đú lọc bằng rõy 38àm.
+ Thu mẫu vào hộp nhựa nhỏ bằng cách dùng bình phun tia gạn tuyến trùng vào trong lọ.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Đếm số lượng tuyến trùng trên 5g rễ bằng kính lúp soi nổi (Nikon SMZ1500).
- Cố định và bảo quản tuyến trùng: Tuyến trùng kí sinh thực vật thu được từ các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào dung dịch TAF để cố định và bảo quản theo phương pháp của Courtney, Polley and Miller (1955).
- Định loại tuyến trùng:
+ Theo các tài liệu phân loại của Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000), Siddiqi (2000). Castillo and Vovlas (2007), Perry and Moens (2009), Ryss (2002).