CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp hồi cứu có đối chứng.
2.3.1. Cách lấy mẫu bệnh nhân nghiên cứu
Lấy theo phương pháp: thu thập các bệnh án của bệnh nhân được chẩn đoán là HCC trong thời gian từ tháng 01/2014 đến tháng 12/2014; bệnh nhân xơ gan và viêm gan mạn từ tháng 5/2014 đến tháng 10/2014 khám và điều trị tại Bệnh viện Hữu Nghị. Sau đó lấy các bệnh án theo tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ ở trên.
2.3.2. Thiết kế nghiên cứu
Điền các thông tin cần thiết của mỗi bệnh nhân vào mẫu bệnh án nghiên cứu (xem phụ lục 2). Khai thác thông tin về tuổi, giới, tiền sử bản thân và gia đình; dựa vào lâm sàng, xét nghiệm hóa sinh, chẩn đoán hình ảnh, giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định các nhóm bệnh nhân HCC, xơ gan, viêm gan mạn. Nhập các số liệu về tuổi, giới, nồng độ AFP, AST, GGT, Bilirubin toàn phần, Albumin, tỉ lệ prothrombin, tình trạng nhiễm virus viêm gan, tình trạng xơ gan, cổ trướng và bệnh não gan của bệnh nhân vào phần mềm excel (chỉ lấy các kết quả xét nghiệm ngay khi vào viện trước khi điều trị).
Sau đó xử lý các số liệu bằng phần mềm thống kê, đưa ra các kết quả nghiên cứu: tuổi và giới của bệnh nhân; nồng độ AFP; ngưỡng AFP cho chẩn đoán HCC ở
bệnh nhân có bệnh gan mạn tính; mối liên quan giữa AFP với một số đặc điểm bệnh gan (tình trạng nhiễm virus viêm gan, xơ gan, chức năng gan theo phân loại Child- Pugh) và một số chỉ số hóa sinh (ALT, AST, GGT, Biliburin toàn phần, Albumin, tỉ lệ prothrombin) ở bệnh nhân HCC. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được trình bày trong hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu
Nhóm HCC
Đặc điểm lâm sàng
So sánh tuổi, giới tính các
nhóm
Xét nghiệm AFP, các chỉ số hóa sinh, chẩn đoán hình ảnh
Xơ gan
Nhóm các bệnh gan khác
So sánh CAFP giữa các nhóm, điểm cắt tối ưu của AFP để chẩn đoán HCC ở bệnh nhân có bệnh gan mạn tính (xơ gan, VGM)
Mối liên quan giữa AFP với đặc điểm bệnh gan và một số
chỉ số hóa sinh ở bệnh nhân HCC
Kết luận
VGM
2.3.3. Phương pháp định lượng AFP
Dùng nguyên lý phân tách hạt từ với công nghệ hóa phát quang để định lượng AFP trên máy miễn dịch tự động Beckman Coulter (Olympus), Model DxI800 và được tiến hành tại Khoa hóa sinh Bệnh viện Hữu Nghị.
Quy trình định lƣợng AFP trên máy miễn dịch tự động Beckman Coulter
Xét nghiệm AFP là một xét nghiệm miễn dịch enzyme hai điểm. Mẫu sẽ được đưa vào bình phản ứng cùng kháng thể đơn dòng kháng AFP-alkaline phosphatase liên hợp từ chuột, cùng với hạt thuận từ được phủ lớp kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên AFP từ chuột. AFP trong mẫu sẽ liên kết với kháng thể đơn dòng cố định kháng AFP tại pha rắn, đồng thời, kháng thể đơn dòng kháng AFP-alkaline phosphatase liên hợp từ chuột sẽ phản ứng với các điểm kháng nguyên trên mẫu AFP. Sau khi ủ trong bình phản ứng, vật chất liên kết pha rắn được giữ lại trong từ trường, trong khi vật chất không liên kết bị trôi đi. Tiếp đó, cơ chất phát quang hóa học Lumi-Phos* 530 sẽ được thêm vào bình và ánh sáng tạo ra từ phản ứng sẽ được đo bằng quang kế có sẵn trong máy. Ánh sáng sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ AFP trong mẫu. Lượng chất phân tích sẽ được xác định thông qua đường cong lưu trữ định cỡ đa điểm hiển thị (Hình 2.2).
Kết quả
Kết quả xét nghiệm bệnh nhân được tự động tính toán dựa trên hệ thống phần mền sử dụng mô hình đường cong toán học 4PLC. Lượng chất cần phân tích trong mẫu được xác định bằng các đo cường độ ánh sáng sinh ra, sử dung dữ liệu hiệu chuẩn lưu trên máy. Kết quả giá trị bình thường theo máy từ 0,5-9 ng/ml .
Giới hạn của phương pháp
Mẫu có thể được đo lường chính xác trong giới hạn phân tích của ngưỡng phát hiện dưới và giá trị chất chuẩn cao nhất (xấp xỉ 0.5-3000 ng/ml [0.41-2478 IU / ml]). Dãy phân tích cho Dil – AFP từ 2700 ng/ml tới xấp xỉ 51000 ng/mL
Nếu một mẫu chứa ít hơn giới hạn phân tích của ngưỡng phát hiện dưới, báo cáo kết quả ít hơn giá trị đó (ie.,< 0.5 ng/mL [< 0.41 IU/ml]). Khi hệ thống pha loãng DxI được sử dụng, hệ thống sẽ báo cáo kết quả ít hơn 2550 ng/mL (2107 IU/ml)
Mẫu chứa hơn 3000 ng/mL có thể được xét nghiệm bằng cách dùng hệ thống pha loãng DxI. Hệ thống pha loãng DxI tự động hóa chu trình pha loãng, sử dụng một lượng mẫu với 100 lượng UniCel DxI Access Immunoassay System Wash Buffer II, cho phép các mẫu được định lượng tới 303000 ng/ml. Hệ thống báo cáo kết quả đã được hiệu chỉnh qua pha loãng. Sơ đồ sau thể hiện nguyên tắc phản ứng định lượng AFP:
Kháng nguyên AFP (Huyết thanh bệnh nhân)
Kháng thể kháng AFP (Gắn alkaline phosphatase)
Kháng thể kháng AFP (Gắn hạt thuận từ)
Trộn và ủ ở 36,5oC trong 5 phút Phức hợp được hình thành Rửa 3 lần
Thêm chất nền → ủ 5 phút Dioxetane-P Dioxetane Phát quang
Hình 2.2. Nguyên lý định lượng AFP 2.3.4. Xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu thập xong sẽ được kiểm tra tính hoàn tất và phù hợp. Sau đó nhập vào máy tính, các số liệu được xử lý theo thuật toán thống kê qua phần mềm SPSS 16.0 for Window.
Cách thức xử lí số liệu bảng phần mềm SPSS 16.0 như sau:
Biểu đồ phân phối tần suất (Histograms with normal curve) của nồng độ AFP huyết tương của nhóm bệnh nhân HCC và nhóm bệnh nhân viêm gan mạn được thực hiện. Sử dụng biểu đồ phân phối này để khảo sát, đánh giá xem phân phối có chuẩn không. Phân phối là chuẩn khi biểu đồ đường cong chuẩn có dạng hình chuông đối xứng với tần số cao nhất nằm ngay giữa và các tần số thấp dần nằm ở 2 bên, giá trị trung bình (mean) và trung vị (median) gần bằng nhau và độ xiên (Skewness) nằm trong khoảng (-1;1) .
Biến có phân bố không chuẩn: So sánh hai giá trị trung vị (median) bằng test Mann-Whitney; So sánh giá trị trung vị nhiều hơn hai nhóm dùng kiểm định ANOVA Kruskal-Wallis hai phía
p < 0,05: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
p > 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê
Tính hệ số tương quan giữa nồng độ AFP huyết tương của nhóm bệnh nhân HCC với một số chỉ số hóa sinh ở nhóm đó sử dụng hệ số tương quan Pearson ký hiệu là r, tương quan r được đánh giá như sau:
- r ≥ 0,7 tương quan chặt
- r = 0,5-0,7 tương quan khá chặt - r = 0,3-0,5 tương quan mức độ vừa - r < 0,3 tương quan mức độ ít - r (+) tương quan thuận - r (-) tương quan nghịch
Đường cong ROC được vẽ thể hiện mối liên quan giữa nồng độ AFP huyết tương và bệnh gan mạn, tìm diện tích dưới đường cong của AFP.
Độ nhạy, độ đặc hiệu của AFP được tính toán trong chẩn đoán HCC tại các điểm cắt khác nhau đồng thời xác định giá trị tiên đoán âm, giá trị tiên đoán dương và độ chính xác của nồng độ AFP tại các điểm cắt đó.
Điểm cắt của nồng độ AFP được xác định tại giá trị có độ chính xác của chẩn đoán cao nhất (tỉ lệ âm tính giả và dương tính giả thấp nhất) và độ đặc hiệu cao nhất với chẩn đoán HCC. Xác định điểm cắt loại trừ HCC của nồng độ AFP tại giá trị có độ nhạy cao nhất.